研究目的： 通过体内外研究幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori, Hp)感染对胃黏膜上皮细胞增殖活性、p53及PUMA蛋白表达的影响,分析它们之间相互关系,从而在体内外探讨Hp对胃黏膜上皮细胞的影响及其机制,为Hp相关疾病的治疗提供新的靶点和方向。 研究方法： 1.临床研究部分：对在我院(2007年1月-2009年9月)行胃镜检查的153例未行Hp根除治疗的患者,取其内镜活检的胃黏膜病变组织进行研究。153例病变包括慢性非萎缩性胃炎(CNAG) 37例,慢性化生性萎缩性胃炎(CAG伴IM)39例,异型增生(DYS)39例,胃癌(GC)38例。应用免疫组化PV-9000法染色及(Giemsa染色检测胃黏膜病变中突变型p53、PUMA蛋白的表达和Hp感染情况。 2.体外实验分组如下：(1)根据NCTC11637Hp上清液浓度进行分组,分为A、B、C、D四组,浓度分别为11mg/ml,5.55mg/ml,2.775mg/ml,1.3875 mg/ml;(2)根据NCTC11639 Hp上清液浓度进行分组,分为A、B、C、D四组,浓度分别为7.5mg/ml,3.75mg/ml,1.875mg/ml,0.9375 mg/ml;(3)以Hp培养液为阴性对照组。各组作用GES-1细胞时间均为24h、48h、72h,用倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)检测细胞生长的抑制率,蛋白质印迹(Western Blot)技术检测p53、PUMA蛋白的表达。 研究结果： 1.临床研究部分 (1)不同胃黏膜病变组织中突变型p53的表达对Hp阳性的CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组的突变型p53进行比较,各组之间无统计学差异(P0.05)；对Hp阴性的CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组的突变型p53进行比较,其中DYS、GC组显著高于CNAG组(P0.05), DYS、GC组显著高于CAG伴IM组(P0.05)；在同一病变中Hp阳性组突变型p53阳性表达一般高于Hp阴性组,突变型p53在CAG伴IM组有显著差异(P0.05)。 (2)不同胃黏膜病变组织中PUMA的表达对Hp阳性的不同胃黏膜病变组织PUMA蛋白进行比较,随病变进展,其PUMA蛋白表达逐渐下降,CNAG组与CAG伴IM、GC组有统计学差异(P0.001-0.05),DYS组与CAG伴IM、GC组有统计学差异(P0.01-0.05)；对Hp阴性的不同胃黏膜病变组织的PUMA蛋白进行比较,随病变进展,其PUMA蛋白表达逐渐下降,其中CNAG组与DYS、GC组有统计学差异(P0.01-0.05),CAG伴IM及DYS组与GC组有统计学差异(P0.001)；在同一病变中Hp阳性组PUMA阳性表达一般低于Hp阴性组,PUMA在CAG伴IM组有显著差异(P0.01)。 (3)对Hp阳性的CNAG、CAG伴IM、DYS组突变型p53与PUMA蛋白的表达行相关性分析,相关系数分别为0.032,-0.222,-0.012,P0.05；对Hp阴性的CNAG、CAG伴IM、Dys组突变型p53与PUMA蛋白的表达行相关性分析,相关系数分别为-0.142,0.221,0.041,P0.05。 2.体外研究部分 (1)形态学变化：在倒置显微镜下观察到两种菌株作用GES-1细胞48小时后形态学上都呈现典型的凋亡改变。 (2)不同基因型Hp培养上清液对GES-1细胞活性的影响 ①据NCTC11637Hp培养上清浓度的不同,24h、72h时,A、B、C、D组的生长抑制率显著高于对照组(P0.001),在48h时,A、B、C组的生长抑制率显著高于对照组(P0.001),但对照组与D组之间无显著差异(P0.05)；24h、48h、72h时,A组的生长抑制率显著高于B、C、D组(P0.001),其中48h、72h时,B组高于C、D组(P0.05),C组显著高于D组(P0.001),24h时,B、C、D组之间无显著差异(P0.05)。②根据作用时间的不同,NCTC11637Hp培养上清作用时间对GES-1细胞生长的抑制作用的影响表明,在11mg/ml、5.55mg/ml、2.775mg/ml、1.3875 mg/ml浓度范围内Hp培养上清作用时间对GES-1细胞的生长抑制有显著差异(P0.001)。在实验A组,72h组的抑制作用均显著高于24h、48h组(P0.001),但24h与48h之间无显著差异(P0.05)；在实验B组和C组,48h和72h的抑制作用均显著高于24h组(P0.001-0.05),但48h和72h组之间无显著差异(P0.05)；在实验D组,24h、48h和72h组之间均无显著差异(P0.05)。③和对照组相比,各实验组的生长抑制率高于对照组,并且随着浓度的增加NCTC11639Hp培养上清对GES-1细胞生长的抑制作用大都增强。24h时,实验A、B组的生长抑制率显著高于对照组(P0.001),但对照组与C、D组无显著差异(P0.05),在48h、72h,A、B、C组的生长抑制率显著高于对照组(P0.001-0.05),对照组与D组无统计学差异(P0.05)；24h,48h、72h, A组显著高于B、C、D组(P0.001-0.05),其中24h、48h,B组高于C、D组(P0.05),C组与D组之间无统计学差异(P0.05),72h,B组高于D组(P0.001),C组显著高于D组(P0.001),B、C组之间无显著差异(P0.05)。④根据NCTC11639Hp培养上清作用时间的不同,在7.5mg/ml、3.75mg/ml、1.875mg/ml、0.9375 mg/ml浓度范围内Hp培养上清作用时间对GES-1细胞的生长有抑制作用。在实验A组,48h和72h组的抑制作用均显著高于24h组(P0.001),48h和72h组之间无显著差异(P0.05)；在实验B组,72h组的抑制作用显著高于24h组(P0.05),但48h与24h、72h组之间无显著差异(P0.05)；在实验C组,72h组的抑制作用显著高于24h、48h组(P0.001-0.05),24h和48h组之间无显著差异(P0.05)；在实验D组,24h、48h、72h组之间均无显著差异(P0.05) (3)不同基因型Hp培养上清液对p53、PUMA蛋白表达的影响 ①2.775mg/mlNCTC11637毒力上清作用GES-1细胞48h后p53蛋白上调(P0.001-0.01),而3.75mg/mlNCTC11639毒力上清作用GES-1细胞48h后p53蛋白无显著变化(P0.05)。②3.75mg/mlNCTC11639毒力上清作用GES-1细胞48h后PUMA蛋白下调(P0.01-0.05),2.775mg/mlNCTC11637毒力上清作用GES-1细胞48h后无显著变化(P0.05)。 结论： 1.突变型p53与PUMA蛋白的异常表达参与了胃黏膜癌变的发生,可能和Hp的早期致病作用有关。 2.不同基因型的Hp培养上清液均能以时间和浓度依赖的方式抑制胃黏膜上皮细胞生长,并诱导细胞凋亡,这可能是Hp导致胃黏膜损伤的机制之一。 3.不同基因型的Hp培养上清液对胃黏膜上皮细胞内p53的蛋白表达影响不同,这可能和菌株毒力不同有关。 4.不同基因型的Hp培养上清液对胃黏膜上皮细胞内PUMA的蛋白表达影响不同,这可能和菌株毒力不同有关。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R57
【部分图文】：
53KDa注:图3一10:l:实验组NeTell637组ps3蛋白表达;2:实验组NeTcll639组p53蛋白表达;3:对照组P53蛋自表达。3.2.3.2不同基因型即培养上清液对PuM^蛋白表达的影响表3一n不同基因型Hp培养上清作用GEs一1细胞后PuMA蛋自表达的比较(n=6)组别实验组(48h)NCTCll637毒力上清 0.7921士0.29对照组(48h) 0.9756切.37P值卜 0.957 P>0.05NCTCll639毒力上清 0.3595士0.41 0.975肚0.0.37拼 2.721 P<0.05由表3一11可见，3.75哩/mlNCTCll639毒力上清作用GEs一l细胞48h后PuMA蛋白下调，与对照组相比有显著差异(P<0.05)。
ACtin43KDa注:图3一:1:实验组NCTCll637组内参:2:实验组NCTCll639组内参;3:对照组内参。53KDa注:图3一10:l:实验组NeTell637组ps3蛋白表达;2:实验组NeTcll639组p53蛋白表达;3:对照组P53蛋自表达。3.2.3.2不同基因型即培养上清液对PuM^蛋白表达的影响表3一n不同基因型Hp培养上清作用GEs一1细胞后PuMA蛋自表达的比较(n=6)组别实验组(48h)NCTCll637毒力上清 0.7921士0.29对照组(48h) 0.9756切.37P值卜 0.957 P>0.05NCTCll639毒力上清 0.3595士0.41 0.975肚0.0.37拼 2.721 P<0.05由表3一11可见，3.75哩/mlNCTCll639毒力上清作用GEs一l细胞48h后PuMA蛋白下调，与对照组相比有显著差异(P<0.05)。
ACtin43KD8注:图3一12:1:实验组 NCTC11637组内参表达:2:实验组NCTCll639组内参表达;3:对照组内参表达。23KDa注:图3一13:1:实验组 NCTC11637组PUMA蛋自表达;2:实验组NCTCll639组PUMA蛋白表达;3:对照组PUMA蛋自表达。3.3讨论 3.3.1不同基因型HP培养上清液对GES一1细胞增殖活性的影响自从1953年认厄仃en和Marshall首次发现Hp以来，已经发现Hp感染与胃炎，消化性溃疡的发生密切相关，同时也是胃赫膜相关淋巴样组织(Gastri。mucosa一ass。。iatedl卿 pheidtissueMALT)淋巴瘤及胃癌等疾病的重要致病因素[40]，Hp单独作用可诱导蒙古沙土鼠胃癌的发生。目前Hp感染确切的致病机制仍不明确，全世界大约有一半以上人口感染Hp，只有10%一20%会发展为消化性溃疡，1%一2%有发展为胃癌的风险[50，””2]
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2890077
