乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α干扰素机制初步探讨
发布时间：2020-11-19 13:54
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。HBV感染可导致肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。HBV属于嗜肝DNA病毒,具有部分双链环状的DNA基因组。HBV通过特有的逆转录反应进行复制。HBV编码的DNA聚合酶/逆转录酶(DNA polymerase/Reverse transcriptase,DNA pol/RT)的结构和功能在其复制过程中起重要作用。1976年,α-干扰素(Interferon-α,IFN-α)被成功用于治疗慢性乙型肝炎,它通过建立细胞内抗病毒状态和免疫调节作用抑制并清除病毒。但临床发现约2/3的患者对IFN-α治疗无反应,这与HBV DNA聚合酶有关。Foster等发现,HBV DNA聚合酶的末端蛋白(TP)可显著抑制细胞对IFN-α反应,并认为是由TP表达阻断IFN-α通路引起。本实验室先前通过构建一系列基因缺失突变体方式,发现HBV DNA聚合酶末端蛋白+Spacer区(部分或全部)具有抗IFN-α作用,其中末端蛋白+部分Spacer区共计257个氨基酸(TP257)抗IFN-α作用尤为明显,但其机制尚不清楚。本研究拟应用AdEasy XL Adenoviral Vector System表达TP257蛋白并通过免疫沉淀筛选与相互作用的细胞蛋白,初步探讨HBV DNA聚合酶TP区IFN-α作用机制,为研制新的抗HBV药物提供新的思路。 为包装重组腺病毒AD-TP257,并在Huh7细胞中获得表达,首先构建穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并重组到腺病毒骨架载体pADEasy-1,通过293A细胞包装重组腺病毒,感染人肝癌细胞Huh7,Western-blot验证TP257蛋白表达;为筛选与TP257抗干扰素效应相关细胞蛋白,分别在重组腺病毒感染细胞前或感染细胞后加入IFN-α,收获细胞蛋白进行免疫沉淀,通过质谱鉴定差异蛋白。实验结果表明重组腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7细胞并大量表达TP257蛋白;重组腺病毒AD-TP257感染细胞后加入IFN-α并通过免疫沉淀筛选到三种候选差异蛋白,经质谱鉴定分别为:热休克蛋白60、组蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白调节轻链12A。因此,TP257可能通过上述蛋白影响病毒的抗干扰素效应。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：
材料和方法料来源、质粒、菌株和细胞 编码 HBV DNA 聚合酶末端蛋白+部分 Spacer 257 个氨基酸 (TP257) 的重组质粒 pNTAPB-TP257 由本实验室构建和空载体重组腺病毒 AD-GFP 由本实验室包装和保存；AdEasy XLiral Vector System 购自 Stratagene 公司，包括 pShuttle-IRES-hrGFP-1pADEasy-1 、BJ5183-Ad-1 和 XL-10 gold 菌株；大肠杆菌 DH5α 由本保存；Huh7 细胞购自 ATCC，293A 购自 Invitrogen 公司。
丙烯酰胺、SDS 、甘氨酸和三羟甲基胺基甲烷 (Tris) 等化学试剂为国产分析纯；PVDF 膜购自 Amersham 公司， Cocktail 蛋白酶抑制剂和 CDP-Star 购自Roche 公司；RIPA 蛋白裂解液及 BCA 蛋白质定量试剂盒购自碧云天公司；Monoclonal ANTI-FLAG M2 Antibody 购自 Sigma 公司，带 AP 标签的羊抗鼠二抗体购自 Santa Cruz 公司；引物由上海博尚生物技术有限公司合成。2.实验方法2.1 构建重组腺病毒流程 (图 2)
2.2.1 pShuttle-IRES-hrGFP-TP257 载体的构建：(1) PCR 扩增 TP257 全长：以质粒 pNTAPB-TP257 为模板，使用 Platinum TaqDNA Polymerase ， 进 行 TP257 基 因 片 段 ( 图 3) ， 所 用 引 物 序 列 为TP257shuIRESF-2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGCCCCTATCTTATCAA-3' ( 下划线为 Not I 位点，方框内为 Kozak 序列 ) ， TP257shuIRESR ： 5'ACGCGTCGACCCACCCCAAAAGACCGCCGTGT -3' (下划线为Sal I位点) ，引物由上海博尚公司合成。扩增采用热启动方式，即：反应先经 95 °C 预变性5min，待温度上升至 80 °C 后加入聚合酶，随后进入循环。
【参考文献】
本文编号：2890072
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：
材料和方法料来源、质粒、菌株和细胞 编码 HBV DNA 聚合酶末端蛋白+部分 Spacer 257 个氨基酸 (TP257) 的重组质粒 pNTAPB-TP257 由本实验室构建和空载体重组腺病毒 AD-GFP 由本实验室包装和保存；AdEasy XLiral Vector System 购自 Stratagene 公司，包括 pShuttle-IRES-hrGFP-1pADEasy-1 、BJ5183-Ad-1 和 XL-10 gold 菌株；大肠杆菌 DH5α 由本保存；Huh7 细胞购自 ATCC，293A 购自 Invitrogen 公司。
丙烯酰胺、SDS 、甘氨酸和三羟甲基胺基甲烷 (Tris) 等化学试剂为国产分析纯；PVDF 膜购自 Amersham 公司， Cocktail 蛋白酶抑制剂和 CDP-Star 购自Roche 公司；RIPA 蛋白裂解液及 BCA 蛋白质定量试剂盒购自碧云天公司；Monoclonal ANTI-FLAG M2 Antibody 购自 Sigma 公司，带 AP 标签的羊抗鼠二抗体购自 Santa Cruz 公司；引物由上海博尚生物技术有限公司合成。2.实验方法2.1 构建重组腺病毒流程 (图 2)
2.2.1 pShuttle-IRES-hrGFP-TP257 载体的构建：(1) PCR 扩增 TP257 全长：以质粒 pNTAPB-TP257 为模板，使用 Platinum TaqDNA Polymerase ， 进 行 TP257 基 因 片 段 ( 图 3) ， 所 用 引 物 序 列 为TP257shuIRESF-2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGCCCCTATCTTATCAA-3' ( 下划线为 Not I 位点，方框内为 Kozak 序列 ) ， TP257shuIRESR ： 5'ACGCGTCGACCCACCCCAAAAGACCGCCGTGT -3' (下划线为Sal I位点) ，引物由上海博尚公司合成。扩增采用热启动方式，即：反应先经 95 °C 预变性5min，待温度上升至 80 °C 后加入聚合酶，随后进入循环。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王林;柏世玉;陈婉南;李晖;林建银;林旭;;乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2007年06期
本文编号：2890072
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2890072.html
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