镉暴露影响肝星状细胞活化及其氧化应激机制研究

发布时间：2020-11-21 11:43

　　 镉(Cadmium,Cd)是一种对人体健康威胁巨大的有毒重金属。急性高剂量的Cd暴露可导致肝、肾等多个脏器的损伤,慢性低剂量的Cd胁迫又与多种肿瘤的发生密切相关。Cd的生物半衰期长达10-30年,经消化道吸收的Cd通过门静脉首先到达肝脏并蓄积于此,因此,肝脏是Cd毒性重要的靶器官之一。在痛痛病患者中肝纤维化发生率显著增高,肝纤维化可能是肝脏高Cd蓄积引起的特异性病理变化。流行病学显示,慢性肝病的进展可能与Cd暴露有关。在动物实验中,长时间Cd暴露可导致肝间质纤维化。然而,Cd暴露在肝纤维化发生、进展中的作用机理尚不清楚。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)与肝纤维化发生及进展有关。肝损伤时,静息状态的HSC被激活转化为肌成纤维细胞并产生αSMA和Ⅰ型胶原纤维参与肝纤维化的发生,而HSC活化状态的维持又与肝纤维化的进展有关。因此,本研究拟从Cd暴露影响HSC的活化及其可能的氧化应激机制着手,以阐释Cd暴露在肝纤维化发生、进展的作用,为进一步理解Cd暴露的肝脏远期效应提供证据。方法:(1)Cd染毒的动物实验,分为4组:空白对照组、GSH对照组、Cd干预组及Cd+GSH干预组。利用生化分析仪检测肝功能指标,HE染色检测肝脏病理改变,Masson染色检测肝组织中胶原分布,免疫组化检测肝组织中αSMA的表达。透射电镜下观察肝细胞及HSC超微结构的变化,分光光度仪或酶标仪检测肝组织中GSH,Vc,SOD,CAT和GSH-Px的水平,Western Blot检测HSC活化标志物,NF-κB及MAPK信号通路中相关蛋白的变化。(2)HSC的体外激活,利用Cd干预L02的条件培养基(CM)干预LX-2细胞,分3组:(L02-CM),(Cd-L02-CM)和(Cd+GSH-L02-CM),检测LX-2中αSMA的表达。(3)利用质谱流式对不同浓度Cd干预的LX-2细胞进行Cd信号及活力的检测。多次低剂量Cd干预(0.5μM,2μM)对HSC-T6细胞表型及功能的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,ROS水平,CCK8实验检测细胞活力,划痕及Transwell实验检测迁移能力,油红O染色检测细胞内脂滴分布,荧光显微镜检测ROS水平,Western Blot检测HSC活化标记物及Nrf-2和NF-κB信号通路中相关蛋白的表达。结果:1.Cd暴露诱导肝细胞氧化损伤,激活HSC。(1)Cd暴露与肝损伤。Cd干预组可使血清AST,GGT及XOD较对照组显著升高(P0.05),给予GSH可降低上述肝损伤指标(P0.05);肝组织HE染色显示,Cd干预组出现炎细胞浸润、肝细胞坏死等病理改变;透射电镜下见Cd干预组细胞线粒体双层膜及内部嵴结构破坏。(2)Cd暴露与HSC激活。Cd干预组肝组织中αSMA蛋白表达量增加,αSMA阳性细胞在脉管周围区域有较多分布。透射电镜下见Cd干预组HSC内部脂滴消失且周围有胶原纤维。而Cd+GSH组较Cd干预组αSMA蛋白表达量下降(P0.05),αSMA阳性细胞主要分布在血管壁,电镜下HSC内富含脂滴,呈静息状态。(3)Cd暴露与体内氧化还原状态的改变。Cd干预组肝脏中小分子抗氧化物GSH及Vc含量升高,但SOD,CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性降低,而Cd+GSH干预组,小分子抗氧化物GSH和Vc升高(P0.05),抗氧化酶SOD,CAT的活性较对照组无明显变化,GSH-Px活性升高(P0.05)。(4)Cd暴露与NF-κB和MAPK信号通路内相关蛋白表达的改变。Cd干预组增加p-P65,p-IKBα及p-JNK蛋白的表达(P0.05);Cd+GSH干预组,上调p-P65蛋白,但p-JNK的表达量较对照组无明显变化(P0.05)。(5)HSC的体外激活。GSH干预可降低L02细胞中Cd含量及ROS的生成,Cd-L02-CM干预后的LX-2细胞αSMA表达增加。2.Cd干预对肝星状细胞表型及功能的影响。(1)LX-2细胞Cd摄取及活力。利用不同浓度Cd干预LX-2 1h后,5μM Cd干预组~(114)Cd阳性细胞比例为98.88%;其~(114)Cd中位信号强度为77.15,高于其他组;对照组、0.5μM和5μM CdCl_2干预组~(195)pt强阳性细胞(代表细胞活力差)的比例分别为11.32%,15.46%和35.5%。CCK8检测发现5μM Cd干预可抑制LX-2细胞增殖。(2)多次低剂量Cd干预后,对HSC-T6细胞功能及表型的影响。对照组、0.5μM和2μM CdCl_2干预组HSC-T6细胞凋亡率未见差异;多次0.5μM Cd干预后,HSC-T6增殖、迁移能力增强。油红O染色可见对照组细胞内脂滴较多见,而Cd干预组脂滴较少。同样的,Cd干预后纤维化相关蛋白αSMA表达量增加,多次Cd干预后的HSC-T6再次Cd干预时Cd摄取能力降低,其p-P65,HO-1蛋白表达量也较对照组增加。(3)低剂量Cd干预后对高剂量Cd暴露的影响。2μM+30μM Cd干预组可在一定程度上对抗高Cd毒性,其细胞活力高于其他组。2μM+30μM Cd干预组ROS生成较少,而0+30μM及0.5+30μM Cd干预组可见ROS强阳性峰。结论:(1)Cd可能通过降低抗氧化酶活性,上调p-JNK蛋白,促进ROS生成,诱导肝细胞氧化损伤,激活HSC。而外源性给予GSH,可减少细胞内Cd摄取,一定程度恢复抗氧化酶活性,并可能通过上调p-P65,抑制p-JNK蛋白表达,减轻氧化损伤,减少HSC激活。(2)Cd可影响活化HSC的功能及表型。多次低剂量的Cd干预HSC后,HSC活化相关标志物表达增加,细胞增殖、迁移能力增强。其活化状态及拮抗高Cd毒性能力的改变可能与上调HO-1,p-P65等蛋白表达有关。(3)质谱流式技术可作为一种研究Cd单细胞毒理的新工具。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：

图 1-2 人体内 Cd 的吸收、代谢、储存及排泄[23].1-2 The process of absorption, metabolism, storage and excretion of Cd in human body在动物试验中，急性 Cd 暴露可导致肝损伤，病理表现为局灶性肝细胞坏核固缩，炎细胞浸润并有血清 ALT 和 AST 升高[24-26]。单次高剂量 C鼠 6 h 后，肝脏的超微结构主要表现为线粒体肿胀，粗面内质网严重扩化并伴核糖体减少[27]。Cd 致急性肝损伤的机制可分为直接损伤和继直接损伤主要包括氧化应激，含巯基基团抗氧化物的失活，线粒体损伤发损伤通常由 Kupffer 细胞的激活并导致炎症反应的发生[28]。长时间的，可诱发 NFS 小鼠产生肝脏肿瘤[29]。此外，在乙型病毒性肝炎表面抗转基因小鼠中，同时给予 Cd 暴露，可使肿瘤分化更差[29]。细胞死亡表型转化是细胞对持续性 Cd 刺激响应的两种常见结局[30]。体外试验浓度的 Cd 可以诱导不同种属来源的肝细胞发生自噬，凋亡，焦亡等不死亡[31-33]。长时间低剂量 Cd 干预(1 μM，28 周)使大鼠肝脏 TRL121

图 1-3 HSC 的活化的途径[149]，HSC 的活化可分为起始刺激和活化维持。Fig.1-3 Pathways of hepatic stellate cell activation[149], Features of stellate cell activation canbe distinguished between those that stimulate initiation and those that contribute to perpetuation.1.2.7 金属蓄积与肝纤维化病毒性肝炎，酒精性肝病是肝纤维化的常见病因，这些肝病以炎性细胞不断浸润，胶原持续堆积为特征。有研究表明氧化应激可以参与调节胶原的生成及纤维化的形成。而金属离子（Cu2+，Fe2+等）作为天然的自由基反应的催化剂具有调控肝纤维化的潜质[150]。此外，许多研究表明在肝硬化患者中存在金属元素代谢的紊乱，表现为检测的生物样本中出现必需元素的减少和毒性重金属的增加，而这种紊乱可能是肝病发展的一个重要原因[42, 43]。铁（ferrum, Fe）是人体必需的微量元素，其作为多种分子的组分参与机体代谢反应。体内的非血基质Fe可嵌入酶的Fe-S中心，调节基因编码酶的生成并参与细胞的增殖和分化[151]。肝脏是Fe贮藏及铁调蛋白合成的主要器官。研究表明肝纤维化及肝硬化进展的过程与肝细胞内Fe超载关系密切。机体中铜、Fe含量

兰州大学博士研究生学位论文 镉暴露影响肝星状细胞活化及其氧化应激机制研究 为肝纤维化的主要效应细胞，在肝纤维化发生及进展中起重要作用，HSC 的激活可促肝纤维化发生，而其持续活化状态又与肝纤维化进展密切相关。综上，本研究拟从 Cd 暴露影响 HSC 的激活与活化状态及其可能的氧化应激机制着手，阐释 Cd 暴露在影响肝纤维化进程中的作用。主要包括两部分：一、通过体内及体外实验研究 Cd 暴露诱导肝细胞氧化损伤对 HSC 激活的影响；二、通过低剂量 Cd 对部分活化的肝星状细胞株进行干预，探讨低剂量 Cd 暴露后对活化 HSC 功能及表型的影响，此外，本部分还将利用质谱流式细胞技术探讨其在单细胞内 Cd 含量测定及细胞活力的运用，从单细胞层面全新视角揭示 Cd 的毒性效应，为 Cd 毒性机理研究提供一种新的研究策略。本研究通过探讨 Cd 暴露如何影响 HSC 的活化及可能的氧化应激，为进一步深入理解 Cd 暴露的肝脏远期效应提供实验的依据。技术路线见下图 1-4／1-5。
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本文编号：2892947