长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞系中HBV基因表达和复制

发布时间：2020-11-22 04:29

【摘要】：目的:HBV的感染一直是困扰人类的一个问题,现有的手段并不能有效地控制其进展,而近年来对RNA干扰的研究证明其在抗病毒方面也有着巨大的潜力。本实验拟评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应。 方法:(1)将HBV基因组中S编码基因的全部核苷酸序列插入至pTARGET载体中,构建重组质粒HBS2(反向插入序列)和HBS4(正向插入序列),并用这两种质粒转染HepG2.2.15细胞。(2)实验分为HBS2组、HBS4组、干扰素组、聚肌胞组和对照组。(3)ELISA法检测各组细胞上清中病毒抗原表达水平。(4)real time PCR法检测各组细胞内和分泌入培养基的HBV DNA水平及细胞内的HBV cccDNA水平。(5)real time RT-PCR检测各组细胞内β-干扰素mRNA水平。(6)Cellular DNA Fragmentation ELISA测定各组细胞的凋亡率。 结果:(1)PCR及测序结果显示HBS2和HBS4质粒构建成功。(2)ELISA结果显示HBS2组、干扰素组、聚肌胞组细胞上清中HBsAg和HBeAg的水平较对照组降低(P0.05),HBS4组HBsAg水平较对照组升高(P0.05),HBeAg水平无变化(P0.05)。(3)real time PCR结果显示HBS2组、干扰素组、聚肌胞组细胞上清中HBV DNA水平和细胞内HBV DNA、HBV cccDNA水平较对照组降低(P0.05),HBS4组则均与对照组无差异(P0.05)。(4)real time RT-PCR结果显示HBS2组、聚肌胞组细胞内β-干扰素mRNA水平较对照组升高(P0.05),HBS4组与对照组无差异(P0.05)。(5)Cellular DNA Fragmentation ELISA结果显示HBS2组、干扰素组和聚肌胞组细胞凋亡率较对照组升高(P0.05),HBS4组与对照组无差异(P0.05)。 结论:长片段反义RNA能抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和病毒复制,且能诱导HepG2.2.15细胞的凋亡。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.62
【图文】：

12000rpm 离心 1min，弃去 溶液 W，12000rpm 离心 1min，弃心 3min，以彻底去除纯化柱中残柱置于新的离心管中，向纯化柱中 2min。12000rpm 离心 1min。测浓A 为模板，PCR 扩增 S 基因的编码，重组质粒经过 PCR 扩增后得到阳序后得到重组质粒 HBS2 和 HBS S 抗原。质粒电泳图见图 1-1。1 2 3 4
【参考文献】

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本文编号：2894122