丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A与USF2相互作用研究

发布时间：2020-12-02 22:23

　　丙型肝炎（Hepatitis C Virus, HCV）是一个全球性危害人类健康的重要病原体,感染后机体极易导致慢性肝炎,并引起肝纤维化、肝硬化、肝坏死,最终导致肝癌。目前对于丙型肝炎病毒致病机制的了解仍旧非常有限。研究发现丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外,病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用在其中发挥重要的作用。在组成病毒的结构蛋白（Struotural Protein）口非结构蛋白中,非结构蛋白NS5A通过与细胞蛋白的相互作用在信号转导、胞内物质转运、抗细胞凋亡以及其它的一些方面发挥了重要作用,研究表明在HCV病毒感染宿主细胞后,在细胞内装配。其中NS5A中的dmainⅡ domainⅢ区域也影响了HCV的复制,并且许多相互作用的后果都能维持或促进病毒在细胞内的持续复制,但其详细机制有待进一步明确。我们通过酵母双杂交系统筛选人类肝脏cDNA文库时得知domainⅡ-Ⅲ与USF2之间有可能存在相互作用,鉴于这两种蛋白质在细胞生理功能上的重要性,我们对其相互作用做了进一步的验证,通过GST融合蛋白沉降技术、免疫共沉淀技术的结果不能证明NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2之间一定存在... 

【文章来源】：湖北大学湖北省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的研究背景
        1.1.1 丙型肝炎病毒介绍
            1.1.1.1 丙型肝炎病毒的结构和特点
            1.1.1.2 HCV病毒在肝细胞的复制过程
            1.1.1.3 HCV基因组结构
        1.1.2 NS5A基因的结构和定位
        1.1.3 NS5A功能与作用
    1.2 USF概述
        1.2.1 USF2的结构
        1.2.2 USF2的功能与疾病发生
            1.2.2.1 USF2的自我剪切
            1.2.2.2 USF2与细胞增殖
            1.2.2.3 USF2与糖脂代谢
            1.2.2.4 USF2与肾脏疾病
    1.3 蛋白质相互作用
        1.3.1 研究蛋白质相互作用的意义
        1.3.2 研究蛋白质相互作用的方法
            1.3.2.1 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system,Y2H system）
            1.3.2.2 GST融合蛋白沉降（GST Pull-Down）技术
            1.3.2.3 免疫共沉淀（immunoprecipation）
    1.4 研究目的
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、细胞系和质粒
            2.1.1.1 菌株
            2.1.1.2 细胞系
            2.1.1.3 质粒
        2.1.2 培养基
        2.1.3 试剂和酶
        2.1.4 主要缓冲液
        2.1.5 仪器和设备
    2.2 方法
        2.2.1 引物序列
        2.2.2 基因扩增体系
        2.2.3 基因扩增条件
        2.2.4 大肠杆菌高效率感受态细胞制备
        2.2.5 大肠杆菌的快速转化
        2.2.6 大肠杆菌的常规转化
        2.2.7 质粒DNA的提取与纯化
            2.2.7.1 碱裂解法抽提质粒DNA
            2.2.7.2 商业化试剂盒抽提质粒DNA
        2.2.8 质粒酶切
        2.2.9 SDS-PAGE检测表达蛋白
        2.2.10 免疫印记检测表达蛋白
        2.2.11 HEK293细胞的复苏
        2.2.12 HEK293细胞的冻存
        2.2.13 哺乳动物细胞系HEK293的组织培养
        2.2.14 哺乳动物细胞的转染
        2.2.15 应用酵母双杂交筛选人类肝脏有限cDNA文库的步骤
            2.2.15.1 有限5×cDNA文库的制备
            2.2.15.2 酵母菌的质粒DNA的小量转化
            2.2.15.3 酵母菌的人类肝脏cDNA文库转化
            2.2.15.4 啤酒酵母中质粒DNA的抽提
            2.2.15.5 一步法转化酵母
            2.2.15.6 酵母大平板的影印
            2.2.15.7 酵母LacZ显色
        2.2.16 GST pull down步骤
        2.2.17 免疫共沉淀步骤
3 结果与分析
    3.1 酵母双杂交结果
        3.1.1 NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ自身激活作用的检测
        3.1.2 以NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ为“诱饵”的筛库结果
        3.1.3 Blast序列比对结果
        3.1.4 在二缺平板SC-Leu-Trp筛选结果
        3.1.5 酵母LacZ显色结果
    3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ和USF2全长基因的扩增
    3.3 GST-pulldown结果
        3.3.1 NS5AdomainⅡ-Ⅲ和Ⅲ与USF2的相互作用对GST-pull down重组质粒的构建
        3.3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ与USF2的原核表达纯化结果
        3.3.3 GST-pull down
    3.4 免疫共沉淀验证NS5A与USF2之间的相互作用
4 讨论与展望
    4.1 讨论
        4.1.1 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2的相互作用
        4.1.2 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2相互作用的生理意义
    4.2 展望
参考文献
致谢



本文编号：2895659