EC-SOD在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的表达变化

发布时间：2017-04-06 22:17

  本文关键词：EC-SOD在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的表达变化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：临床上在进行肝脏手术如肝脏部分切除、肝脏移植以及处理严重肝脏外伤时往往需要暂时性阻断肝脏血流一段时间后再重新恢复其血液供应。在这个过程中就造成了肝脏的缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)。HIRI是肝脏外科手术过程中一种常见的病理生理现象。肝脏的缺血再灌注可引起严重的肝细胞损伤和肝功能障碍,这也是导致术后肝功能衰竭和病人预后较差的重要原因之一。研究已证实,导致这种损伤的主要机制之一为氧化应激反应。缺血再灌注时机体会产生大量活性氧自由基(reac-tive oxygen species,ROS)。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等。ROS的化学性质非常活泼,可以破坏细胞内的蛋白质、DNA和脂类等生物大分子,引起细胞死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是机体内一种重要的抗氧化酶,负责清除O2-,它能将O2-转化成H2O2和氧,在机体抗氧化应激反应中具有重要作用。在哺乳动物SOD共有三种亚型:Mn-SOD存在于线粒体,Cu/Zn-SOD主要位于细胞质和细胞核。细胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是唯一位于细胞外的SOD亚型,并通过其肝素结合结构域(heparin-binding domain,HBD)与细胞表面和细胞外基质相结合。其次,EC-SOD也存在于细胞外液,如血清,脑脊髓液,腹水和滑膜液等。以往对于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更强的抗氧化应激和抗炎作用。EC-SOD在肝脏缺血再灌注损伤模型的表达如何变化,是否也发挥了抗氧化作用,有待证实。本研究通过无损伤血管夹夹闭通往大鼠肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂30 min后松开血管夹,制造大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,6小时后观察肝脏组织的形态结构改变、MDA含量变化以及EC-SOD m RNA水平和蛋白水平的变化,进一步探讨缺血再灌注损伤过程中肝脏组织的氧化应激状态以及EC-SOD的抗氧化作用,为肝脏缺血再灌注损伤的防治提供一条新思路。目的:观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肝组织内的氧化应激状态,观察EC-SOD的表达变化,探讨其在抗氧化应激反应中的作用。方法:1动物分组及缺血再灌注损伤模型的制备Wister雄性大鼠12只,体重200±10 g,由河北医科大学实验动物中心提供,随机分为两组:对照组(Con)和缺血再灌注损伤组(HIRI),用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),参照Kohli等人的方法,分离肝血管和胆管蒂,以无创伤性血管夹夹闭通往肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂。30分钟后去掉血管夹,恢复肝脏血液供应,制造70%肝实质的肝脏缺血再灌注损伤模型。对照组大鼠只分离血管和胆管蒂并不夹闭。6小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清,用于ALT(丙氨酸氨基转移酶)测定;处死大鼠取肝脏,一部分4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肝组织形态学改变。一部分置于液氮中用于EC-SOD m RNA水平和蛋白水平检测,以及MDA含量测定2测定指标及方法2.1血清ALT水平测定血清ALT水平由全自动生化分析仪测定。2.2 HE染色观察大鼠肝脏的形态结构肝组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肝组织形态变化并进行图象分析。2.3大鼠肝组织MDA含量测定将从-70℃冰箱中取出的肝组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%肝组织匀浆,肝组织匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠肝组织EC-SOD m RNA水平测定采用Trizol提取肝组织总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内参照,进行RT-PCR。分别以EC-SOD的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示m RNA的相对表达量。2.5大鼠肝组织EC-SOD蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠肝组织EC-SOD蛋白水平。将大鼠肝组织制成匀浆,离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定.电泳的蛋白上样量为56 ug.经过转膜和封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD抗体,室温静置过夜。再加入荧光标记的抗兔Ig G抗体.在双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肝组织的形态学改变光学显微镜下可见Con组大鼠肝细胞排列成条索状,围绕中央静脉成放射状排列,肝索间肝血窦大小均匀,无明显扩张充血。而HIRI组大鼠的肝组织淤血严重,肝血窦明显扩张充血,肝细胞受压萎缩,部分肝细胞胞浆染色变浅,胞质内出现空泡变性且空泡数量较多,但坏死不明显。2血清ALT水平测定Con组大鼠血清中ALT为20.03±5.23U/L,而HIRI组血清ALT为87.43±9.06 U/L。HIRI组大鼠血清ALT水平明显高于Con组(P0.01)。3肝浆内MDA的含量匀浆内的MDA含量为12.75±2.25 mmol/g。HIRI组大鼠肝匀浆内的MDA含量明显高于Con组(P0.01)。4肝组织EC-SOD mRNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠肝组织内EC-SOD m RNA的相对表达量。Con组肝组织内EC-SOD m RNA的相对表达量为0.68±0.11,HIRI肝组织内EC-SOD m RNA的相对表达量为1.13±0.18,HIRI组大鼠肝组织内EC-SOD m RNA水平明显高于Con组(P0.01)。说明HIRI组大鼠肝组织内EC-SOD的基因表达水平升高。5大鼠肝组织EC-SOD蛋白水平Con EC-SOD 0.74±0.14HIRI大鼠肝组织内EC-SOD的蛋白表达水平为1.10±0.22。HIRI组EC-SOD蛋白水平明显高于对照组(P0.01)。说明HIRI组大鼠肝组织内EC-SOD的蛋白表达水平升高。结论:1结扎肝左、中血管和胆管蒂可成功建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型。2肝脏缺血再灌注损伤模型的肝脏组织已遭受氧化应激损伤,肝脏功能严重受损,EC-SOD基因和蛋白表达水平均明显增强。提示EC-SOD在肝脏缺血再灌注损伤过程中可能发挥了抗氧化应激作用,对肝细胞具有保护功能。
【关键词】：缺血再灌注损伤 EC-SOD ALT HE 氧化应激
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-22
• 结果22-23
• 附图23-30
• 附表30-32
• 讨论32-33
• 结论33
• 参考文献33-36
• 综述 氧化应激、促氧化剂与抗氧化剂的研究进展36-47
• 参考文献42-47
• 致谢47-48
• 个人简历48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 胡礼宏;韩新生;郭建荣;;雌激素与雌激素受体在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用[J];中国临床药理学杂志;2011年03期

2 ;Alanyl-glutamine dipeptide inhibits hepatic ischemiareperfusion injury in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2006年09期

3 张芳芳;郑一凡;祝慧娟;沈筱筠;朱心强;;山奈酚和槲皮素对大鼠细胞色素P450酶活性的影响[J];浙江大学学报(医学版);2006年01期

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本文编号：289777