棕榈酸上调FAT/CD36表达致HepG2细胞脂质积聚的机制研究
发布时间：2020-12-11 18:01
目的观察脂肪酸转位酶FAT/CD36在棕榈酸诱导的HepG2细胞内脂质积聚中的作用,并探讨其分子机制。方法 HepG2细胞分对照组和棕榈酸组,用Western blot、双荧光素酶报告基因、荧光定量PCR、多聚核糖体分析检测棕榈酸对CD36表达、启动子活性和蛋白翻译效率的影响;油红O染色和FFA定量测定反映细胞内脂质含量;荧光显微镜实时观察细胞对FFA的动态摄入。然后将小干扰RNA转染到HepG2细胞,构建低表达CD36的HepG2细胞和阴性对照HepG2。用油红O染色,FFA定量和荧光显微镜观测棕榈酸负荷的转染细胞内脂质积聚和FFA摄取。结果棕榈酸能促进HepG2细胞CD36的表达,增强其启动子活性,增加蛋白翻译效率;棕榈酸组细胞内脂滴增多,FFA含量(240.17±19.83)ng/mg明显高于对照组(144.60±53.52)ng/mg(P<0.05),脂肪酸摄取速度也明显快于对照组;低表达CD36的HepG2细胞中CD36的mRNA和蛋白含量仅为阴性对照细胞的58%和50%。低表达CD36的HepG2细胞内脂滴明显少于阴性对照,FFA水平(98.38±14.18)ng/m...
【文章来源】：第三军医大学学报. 2015年13期 第1308-1313页 北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Westernblot检测棕榈酸对HepG2细胞CD36蛋白
高密度图2CD36启动子载体的构建及棕榈酸对CD36翻译效率的影响2．3棕榈酸对HepG2细胞内脂质积聚的影响普通HepG2细胞用0、0．16mmol/L棕榈酸处理24h后，正置显微镜观察油红O染色结果发现:与对照组(Control)相比，棕榈酸组(PA)的HepG2细胞内橘红色脂滴增加;同时用酶联免疫吸附实验检测HepG2细胞内FFA含量发现棕榈酸处理组(240．17±19．83)ng/mg较对照组(144．60±53．52)ng/mg明显升高(P＜0．05，n=4)，结果与油红O染色结果一致(图3A)。在显微镜下动态观察发现棕榈酸处理组的细胞对FL-C16的摄取速率较对照组加快(图3B)。A:HepG2细胞油红O染色及细胞内FFA定量(×400);B:HepG2细胞对荧光标记FFA的动态摄取摄像(×200)图3棕榈酸对HepG2细胞内脂质积聚的影响2．4抑制CD36表达对HepG2细胞CD36表达及细胞内脂质积聚的影响我们将CD36-siＲNA和NC-siＲNA瞬时转入HepG2细胞成功构建了低表达CD36的HepG2细胞(CD36-siＲNA-HepG2，CD36ＲNAi)和阴性对照HepG2(NC-siＲNA-HepG2，NC)。CD36ＲNAi的HepG2中CD36mＲNA与蛋白分别为NC组的(0．58±0．08)(P＜0．05，n=6)，(0．50±0．10)(P＜0．05，n=3)。给予CD36ＲNAi和NC组细胞0．16mmol/L棕榈酸处理24小时后，油红O染色(图4A)发现CD36ＲNAi组细胞内脂滴明显少于NC组，与细胞内FFA定量测定结果相符［NC组(240．17±21．12)ng/mg，CD36ＲNAi组(98．38±14．18)ng/mg，P＜0．05，n=4］，显微镜下动态观察也证实CD36ＲNAi组细胞对脂肪酸的摄入速度明显慢于NC组细胞(图4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol．37，No．13Jul．152015
A:ＲNA干扰后HepG2细胞的CD36蛋白表达;B:ＲNA干扰后HepG2细胞的油红O染色(×400);C:ＲNA干扰后HepG2细胞对荧光标记FFA的动态摄取摄像(×200)图4抑制CD36表达对HepG2细胞内脂质积聚的影响3讨论NAFLD是一组无过量饮酒史，又除外其他肝病的以肝细胞内中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)过度堆积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，后者可发展为肝癌［10－11］。几乎所有NAFLD患者的血清游离脂肪酸含量较正常人群有不同程度的升高［12］，而且NAFLD患者肝内的脂质约有60%都来源于外周，因此血循环中的脂肪酸异常转运至肝细胞内，是导致肝脏脂质异常积聚的重要原因［13］。CD36是具有多种功能的膜蛋白，如介导长链脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜转运，黏附多种生物大分子并通过胞内信号传导引发相应的炎症、噬菌、内吞功能等［14］。既往研究提示CD36与NAFLD的发生发展密切相关:NAFLD患者的肝脏CD36表达增加，且CD36的表达量与肝脏脂肪变性程度呈正相关［15］;而改善小鼠的肝内脂质积聚后，其肝脏的CD36表达也相应地降低［16］。但是，CD36参与NAFLD发生的具体机制尚不清楚。本研究表明棕榈酸可以明显上调HepG2细胞中CD36蛋白的表达。蛋白的表达受到多因素的复杂调控，其中，基因转录水平及蛋白翻译水平的调节至关重要。因此，我们首先构建了人CD36启动子的表达质粒，将其转染HepG2细胞，测定CD36启动子活性，同时应用荧光定量PCＲ测定细胞CD36的mＲNA表达。结果表明:棕榈酸对CD36的转录有明显促进作用。进一步，我们应用多聚核糖体分析观察了棕榈酸对CD36蛋白翻译的影响。核糖体是生物体蛋白质合成的场所，mＲNA与核糖体结合后启动蛋白翻译，与寡核糖体结合
【参考文献】：
期刊论文
[1]Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. Serkan Dogan,Gokmen Zararsiz,Sebnem Gursoy,Kadri Guven,Omer Ozbakir,Munis Dundar,Mehmet Yucesoy. World Journal of Hepatology. 2014(08)
[2]TNF-α对HepG2细胞LXRα介导的胆固醇外流的影响及其分子机制[J]. 仝莎,陈曜,赵蕾,黄爱龙,阮雄中,陈压西. 中国病理生理杂志. 2013(02)
[3]非酒精性脂肪性肝炎患者血清游离脂肪酸的检测及其临床意义[J]. 李红山,朱德东,李德周. 中国卫生检验杂志. 2013(01)
[4]非酒精性脂肪性肝病兔脂肪肝程度与肝组织硫化氢浓度的关系[J]. 谭华炳,朱德文,谢杏榕,李芳,胡波,李金科. 第三军医大学学报. 2010(22)
[5]炎症应激加重CD36基因敲除小鼠胰岛素抵抗[J]. 陈显,柳青,雷寒,刘宏. 第三军医大学学报. 2010(09)
[6]非酒精性脂肪肝患者血浆FGF21水平及与肥胖、胰岛素抵抗关系研究[J]. 周婷婷,秦波,郑天鹏,朱其荣,刘汉屈. 第三军医大学学报. 2010(03)
本文编号：2910984
【文章来源】：第三军医大学学报. 2015年13期 第1308-1313页 北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Westernblot检测棕榈酸对HepG2细胞CD36蛋白
高密度图2CD36启动子载体的构建及棕榈酸对CD36翻译效率的影响2．3棕榈酸对HepG2细胞内脂质积聚的影响普通HepG2细胞用0、0．16mmol/L棕榈酸处理24h后，正置显微镜观察油红O染色结果发现:与对照组(Control)相比，棕榈酸组(PA)的HepG2细胞内橘红色脂滴增加;同时用酶联免疫吸附实验检测HepG2细胞内FFA含量发现棕榈酸处理组(240．17±19．83)ng/mg较对照组(144．60±53．52)ng/mg明显升高(P＜0．05，n=4)，结果与油红O染色结果一致(图3A)。在显微镜下动态观察发现棕榈酸处理组的细胞对FL-C16的摄取速率较对照组加快(图3B)。A:HepG2细胞油红O染色及细胞内FFA定量(×400);B:HepG2细胞对荧光标记FFA的动态摄取摄像(×200)图3棕榈酸对HepG2细胞内脂质积聚的影响2．4抑制CD36表达对HepG2细胞CD36表达及细胞内脂质积聚的影响我们将CD36-siＲNA和NC-siＲNA瞬时转入HepG2细胞成功构建了低表达CD36的HepG2细胞(CD36-siＲNA-HepG2，CD36ＲNAi)和阴性对照HepG2(NC-siＲNA-HepG2，NC)。CD36ＲNAi的HepG2中CD36mＲNA与蛋白分别为NC组的(0．58±0．08)(P＜0．05，n=6)，(0．50±0．10)(P＜0．05，n=3)。给予CD36ＲNAi和NC组细胞0．16mmol/L棕榈酸处理24小时后，油红O染色(图4A)发现CD36ＲNAi组细胞内脂滴明显少于NC组，与细胞内FFA定量测定结果相符［NC组(240．17±21．12)ng/mg，CD36ＲNAi组(98．38±14．18)ng/mg，P＜0．05，n=4］，显微镜下动态观察也证实CD36ＲNAi组细胞对脂肪酸的摄入速度明显慢于NC组细胞(图4B)。1311第37卷第13期2015年7月15日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol．37，No．13Jul．152015
A:ＲNA干扰后HepG2细胞的CD36蛋白表达;B:ＲNA干扰后HepG2细胞的油红O染色(×400);C:ＲNA干扰后HepG2细胞对荧光标记FFA的动态摄取摄像(×200)图4抑制CD36表达对HepG2细胞内脂质积聚的影响3讨论NAFLD是一组无过量饮酒史，又除外其他肝病的以肝细胞内中性脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)过度堆积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，后者可发展为肝癌［10－11］。几乎所有NAFLD患者的血清游离脂肪酸含量较正常人群有不同程度的升高［12］，而且NAFLD患者肝内的脂质约有60%都来源于外周，因此血循环中的脂肪酸异常转运至肝细胞内，是导致肝脏脂质异常积聚的重要原因［13］。CD36是具有多种功能的膜蛋白，如介导长链脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的跨膜转运，黏附多种生物大分子并通过胞内信号传导引发相应的炎症、噬菌、内吞功能等［14］。既往研究提示CD36与NAFLD的发生发展密切相关:NAFLD患者的肝脏CD36表达增加，且CD36的表达量与肝脏脂肪变性程度呈正相关［15］;而改善小鼠的肝内脂质积聚后，其肝脏的CD36表达也相应地降低［16］。但是，CD36参与NAFLD发生的具体机制尚不清楚。本研究表明棕榈酸可以明显上调HepG2细胞中CD36蛋白的表达。蛋白的表达受到多因素的复杂调控，其中，基因转录水平及蛋白翻译水平的调节至关重要。因此，我们首先构建了人CD36启动子的表达质粒，将其转染HepG2细胞，测定CD36启动子活性，同时应用荧光定量PCＲ测定细胞CD36的mＲNA表达。结果表明:棕榈酸对CD36的转录有明显促进作用。进一步，我们应用多聚核糖体分析观察了棕榈酸对CD36蛋白翻译的影响。核糖体是生物体蛋白质合成的场所，mＲNA与核糖体结合后启动蛋白翻译，与寡核糖体结合
【参考文献】：
期刊论文
[1]Circulating microRNAs in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. Serkan Dogan,Gokmen Zararsiz,Sebnem Gursoy,Kadri Guven,Omer Ozbakir,Munis Dundar,Mehmet Yucesoy. World Journal of Hepatology. 2014(08)
[2]TNF-α对HepG2细胞LXRα介导的胆固醇外流的影响及其分子机制[J]. 仝莎,陈曜,赵蕾,黄爱龙,阮雄中,陈压西. 中国病理生理杂志. 2013(02)
[3]非酒精性脂肪性肝炎患者血清游离脂肪酸的检测及其临床意义[J]. 李红山,朱德东,李德周. 中国卫生检验杂志. 2013(01)
[4]非酒精性脂肪性肝病兔脂肪肝程度与肝组织硫化氢浓度的关系[J]. 谭华炳,朱德文,谢杏榕,李芳,胡波,李金科. 第三军医大学学报. 2010(22)
[5]炎症应激加重CD36基因敲除小鼠胰岛素抵抗[J]. 陈显,柳青,雷寒,刘宏. 第三军医大学学报. 2010(09)
[6]非酒精性脂肪肝患者血浆FGF21水平及与肥胖、胰岛素抵抗关系研究[J]. 周婷婷,秦波,郑天鹏,朱其荣,刘汉屈. 第三军医大学学报. 2010(03)
本文编号：2910984
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