hTERT修饰的成人肝细胞及其对肝炎病毒易感性的研究

发布时间：2020-12-13 12:15

　　由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等人嗜肝病毒感染所导致的急、慢性病毒性肝炎,以及由此发展成的肝硬化和肝癌是严重危害人类健康的重大传染性疾病。目前全球至少有3.6亿HBV慢性感染者和1.7亿HCV感染者,每年由于HBV和HCV感染导致死亡的人数达1500万。过去的十多年间,虽然在预防和治疗急、慢性病毒性肝炎方面取得了一定进展,但也带来了许多问题,其中比较突出的是缺乏特效治疗药物以及耐药性病毒株的出现,而制约这一工作进程的难题之一是没有适用于药物筛选的肝炎病毒体外感染细胞模型和实验动物评价模型。用肝炎病毒阳性血清直接感染原代培养的人肝细胞或胎肝细胞是研究嗜肝性病毒自然感染和复制的最佳方式,但由于胎肝细胞的分化程度影响着其对肝炎病毒的易感性,因此用原代人肝细胞研究肝炎病毒进入细胞的早期感染过程以及由此引起的细胞先天免疫等方面具有不可比拟的优势。人肝细胞属于高度分化的类上皮细胞。体外培养的人肝细胞生存期短,很快失去增值分化能力,细胞衰老、死亡。细胞的生存寿命与细胞内端粒的长度密切相关。端粒位于染色体末端,由... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：72 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

HCV基因结构及复制子结构（R.Bartenschlager,2007）

前言图2 人肝嵌合鼠（H. Barth et al. 2008）血清中的病毒是以一种复合物的形式存在[16,17]，来源于血清中的病毒颗粒不同于转基因细胞所产生的病毒，其与靶细胞的结合和穿入具有本身的特点。用HBV或HCV阳性血清直接感染人肝细胞是最理想的方式[18,19]，采用这种感染方式可以研究不同基因型嗜肝病毒的感染机制、耐药机制，筛选肝细胞表面病毒感染的相关分子以及细胞在病毒作用下的先天免疫反应等。由于人肝细胞来源有限、体外培养困难以及它在嗜肝性病毒感染研究中的重要作用，本研究应用 hTERT 转染人原代成体肝细胞，对其进行修饰，通过激活细胞本身的端粒酶来延长人肝细胞的体外存活时间，建立肝炎病毒体外感染细胞模型

图 1-1 体外培养肝细胞克隆的生成及其扩大培养（100×）A：分离肝细胞(未加红细胞裂解液)；B~H：培养 1~7 天的肝细胞克隆形态；I：肝细胞克隆的扩大培养3.2 肝脏特异性基因的 mRNA 分析琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的RNA三条带清晰可见，无降解。以随机引物Oligo d (T)15反转录合成cDNA的第一条链，然后用设计的针对肝特异性基因的引物扩增肝特异性表达基因ALB、AAT、HGF、CK18、TF、AFP和GS的mRNA，结果显示，在培养 7 天的肝细胞内可检测到肝特异性基因ALB、AAT、 HGF、CK18、TF和GS的mRNA，而未检测到原癌基因AFP的mRNA（图 1-2），各扩增片段与所预期的大小一致。


本文编号：2914520