荧光HBV病毒体的形态学鉴定及在活细胞中的研究

发布时间：2020-12-16 00:47

　　【目的】:制备双砷染料标记的荧光乙型肝炎病毒（hepatits B virus,HBV）体,对其形态学进行鉴定分析,并动态观察HBV荧光体在活细胞中的生物学行为。【方法】:采用脂质体介导的方法,将已成功构建带有TC标签的1.3倍乙型肝炎病毒基因组的载体质粒（pTHBV1.3-mTC1）瞬时转染入人肝癌细胞株中,该重组载体是通过PCR定点基因突变技术将一个能与双砷荧光染料特异性结合的TC标签（C-C-P-G-C-C）在基因水平上插入到HBV核心蛋白免疫主区c/el位点。48h后通过间接免疫荧光检测表面抗原在细胞内的表达与分布;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）的表达;同时收集转染细胞上清液,经不连续蔗糖密度梯度离心进行分离和纯化后,加抗体孵育进行免疫电镜观察分析,同等培养条件下HepG2细胞和2.2.15细胞培养上清液分别作为阴性和阳性对照。活细胞研究中,我们应用Oregon Green ? 488 Taxol标记微管骨架后,在活细胞时差共聚焦显微镜下观察荧光HBV病毒体在宿主细胞中的运输过程。【结果】:间接免疫荧光结果显示在转染pTHBV1.3... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

扩增后两种质粒DNA的电泳鉴定

本部分图片：1 M 210000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bp图 1：扩增后两种质粒 DNA 的电泳鉴定: MarkerDL10000；1：突变质粒 pTHBV1.3-mTC1，共三个复孔；2：野生THBV1.3，共三个复孔

图 3：表面抗原在细胞内的表达及与双砷染料的共定位分别用相差显微镜和共聚焦显微镜拍摄，1：转染野生型质粒 pTHBV1.3 组；2：转突变质粒 pTHBV1.3-mTC1 组；3：未转染空白对照组。DAPI(细胞核染料，蓝色抗表面抗原抗体（绿色），ReAsH（双砷染料，红色）。（标尺：50μm）图 4：共聚焦显微镜观察转染 48h 后培养上清悬液中双砷标记结果左图为转染野生型质粒 pTHBV1.3 组培养上清液；右图为转染 pTHBV1.3-mTC培养上清液。两者显示明显的荧光强度差异，显示此荧光为特异性标记。（b50μm）


本文编号：2919206