hADSCs肝样分化、标记及Caveolin-1在分化中的作用

发布时间：2020-12-23 08:18

　　终末期肝病是由多种急慢性肝病导致的临床综合征。应用干细胞再生产生正常肝细胞代谢功能的“肝脏组织”,进行体外支持或体内植入,可以解决肝脏来源的疑难。脂肪间充质细胞（ADSCs）作为自体细胞移植的种子细胞在再生医学中发挥着重要作用。由于能在体外培养稳定扩增,并在体内和体外分化成为肝细胞,ADSCs可以作为自体干细胞治疗肝脏疾病的种子细胞。Caveolin-1（窖蛋白-1,Cav-1）是组成胞膜窖的主要功能蛋白。由于在脂滴和新生细胞膜的形成以及肝再生的能量供应中发挥着重要作用,因此是Cav-1肝再生所必需的蛋白。然而,Cav-1是否参与并影响ADSCs向肝细胞分化这一过程尚不明确。目的：本论文以人脂肪间充质干细胞为实验对象,利用生长因子联合诱导技术建立肝样细胞模型,通过检测干细胞向肝样细胞诱导过程中Cav-1蛋白的表达,初步探讨Cav-1在肝样细胞诱导分化过程中的作用及介导的相关信号途径,旨在了解干细胞向肝细胞诱导分化的机制。方法：1、分离、提取及培养人源脂肪间充质干细胞并鉴定其性质。2、通过HGF、bFGF、EGF和Dex联合诱导,免疫荧光及RT-PCR方法对诱导细胞进行鉴定。3、体外MR... 

【文章来源】：辽宁师范大学辽宁省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
    论文选题意义
    研究目的及内容
1 文献综述肝脏干细胞组织工程研究进展及应用前景展望
    1.1 肝脏干细胞
        1.1.1 胚胎肝脏干细胞
        1.1.2 成体肝脏干细胞
        1.1.3 非肝源性干细胞
    1.2 肝脏干细胞体外扩增的有效手段——三维培养
        1.2.1 支架材料
        1.2.2 生物反应器
        1.2.3 肝脏干细胞移植体内定植的理想方式——肝脏干细胞可降解支架在生物反应器内形成的复合体
    1.3 展望
2 脂肪间充质干细胞体外分离、提取及向肝样细胞诱导分化
    2.1 前言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 新鲜的脂肪组织
        2.2.2 主要仪器
        2.2.3 实验试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 人脂肪间充质干细胞原代培养
        2.3.2 人脂肪间充质干细胞传代及扩增
        2.3.3 人脂肪间充质干细胞生长曲线的检测
        2.3.4 流式细胞仪检测人脂肪间充质干细胞的表型
        2.3.5 人脂肪间充质干细胞向成骨细胞的诱导及鉴定
        2.3.6 人脂肪间充质干细胞向脂肪细胞的诱导及鉴定
        2.3.7 人脂肪干细胞向肝细胞的诱导
        2.3.8 免疫荧光法检测AFP、ALB蛋白的表达
        2.3.9 RT-PCR检测肝细胞特异性基因的表达
        2.3.10 Elias检测诱导后细胞上清液尿素含量
    2.4 结果
        2.4.1 人脂肪间充质干细胞的形态观察
        2.4.2 原代培养第3代人脂肪间充质干细胞的增殖情况
        2.4.3 人脂肪间充质干细胞表型的检测
        2.4.4 人脂肪间充质干细胞向成骨、成脂细胞的分化潜能
        2.4.5 不同诱导时期细胞ALB、AFP蛋白的表达
        2.4.6 不同诱导时期分化标志性基因的表达
        2.4.7 不同诱导时期尿素含量的表达
    2.5 讨论
    2.6 小结
3 超顺磁性氧化铁对脂肪间充质干细胞标记的体外研究
    3.1 前言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 细胞
        3.2.2 干细胞标记物
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 主要仪器
    3.3 方法
        3.3.1 脂肪间充质干细胞原代培养、扩增及鉴定
        3.3.2 标记后细胞存活率及标记率的检测
        3.3.3 MTT检测标记后细胞增殖活力
        3.3.4 Annexin/碘化吡啶（PI）双染色法检测细胞凋亡
        3.3.5 标记细胞流式细胞检测细胞表面CD分子
        3.3.6 标记细胞成脂成骨分化
        3.3.7 体外磁标细胞核磁共振影像
    3.4 结果
        3.4.1 SPIO标记人脂肪间充质干细胞形态学观察
        3.4.2 不同浓度SPIO标记脂肪间充质干细胞
        3.4.3 SPIO标记细胞MTT
        3.4.4 SPIO标记细胞凋亡检测
        3.4.5 MIR检测标记情况
        3.4.6 流式细胞仪鉴定细胞表面CD分子表达
        3.4.7 标记后成脂成骨分化潜能
    3.5 讨论
    3.6 小结
4 Caveolin-1在脂肪间充质干细胞向肝脏诱导分化过程中的表达
    4.1 前言
    4.2 材料与仪器
        4.2.1 细胞
        4.2.2 主要仪器
        4.2.3 主要试剂
    4.3 方法
        4.3.1 冻存细胞的复苏
        4.3.2 人脂肪干细胞向肝细胞的诱导
        4.3.3 免疫荧光法检测Cav-1、ER-α36蛋白的表达与定位
        4.3.4 免疫印迹杂交检测不同诱导时期细胞相关蛋白的表达
    4.4 结果
        4.4.1 不同诱导时期肝样细胞中Cav-1与ER-α36蛋白的表达
        4.4.2 不同诱导时期肝样细胞p-MAPK、MAPK蛋白的表达
    4.5 讨论
    4.6 小结
结论
参考文献
附录A 中英文对照及缩略语
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：2933379