COX-2shRNA通过诱导肝星状细胞衰老改善肝纤维化的作用机制研究
发布时间：2020-12-31 13:59
目的构建靶向COX2-shRNA慢病毒载体,观察COX-2shRNA对肝星状细胞衰老的影响,探讨其对肝纤维化的抑制作用及机制。方法1.构建3条COX-2shRNA序列至慢病毒载体GV248中,感染大鼠HSC-T6细胞株,通过实时荧光定量PCR技术筛选出干扰效率最高的COX-2shRNA序列。2.将干扰效率最高的COX-2shRNA慢病毒载体,通过尾静脉注射到高脂-CCL4诱导的肝纤维化模型大鼠中。12周末,处死大鼠。油红“O”染色（冰冻切片）、HE染色和Masson染色分析肝组织脂肪变性及纤维病变程度;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;实时荧光定量PCR检测肝组织匀浆COX-2mRNA、α-SMAmRNA、p53mRNA的表达。同时检测血清总胆固醇、甘油三酯、谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。3.以大鼠HSC-T6细胞株为研究对象,应用PFT-α抑制p53活性来研究p53通路在COX-2shRNA诱导HSC-T6衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,CCK8检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期,q-PCR检测p53mRNA及p21mRNA的表达。结果1.通过qPCR对3条序列慢病毒干扰...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１?ＲＮＡｉ慢病毒载体构建实验流程??Ｆｉｇ．?１－１?ＲＮＡｉ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ??．
针对大鼠Ｃ０Ｘ－２基因ｓｈＲＮＡ慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）栽体的构建及鉴定??心ｌｍｉｎ，弃下层废液；??６００）ｉｌ预先配置好的漂洗液，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃下层废０００?ｒｐｍ空离２?ｍｉｎ，进一步除去残留的漂洗液；??净台中将回收柱转移至新的１．５?ｍｌ?ＥＰ管中，静置１０？２０?ｍｉｎ，收柱中加入９５?｜ｉｌ?Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ?Ｗａｔｅｒ，静置２?ｍｉｎ，１２０００?ｒｐｍ品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。??与质量检测??
１）测定前一天，使用２９３Ｔ贴壁细胞铺板，９６孔板，每孔４ｘｌ〇个细胞，体积??００?＾１；??２）根据病毒的预期滴度，准备７？１０个无菌的ＥＰ管，每管中加入９０?０无血清??养基；??３）取待测定的病毒原液１０＃加入到第一个管中，混匀后，取１０?ＩＩ伽入到第??个管中，继续相同的操作直到最后一管；??４）选取所需的细胞孔，弃去９０?４培养基，加入９０?０稀释好的病毒溶液，培??箱培养；５）２４?ｈ后，加入完全培养基１００?４，小心操作，不要吹起细胞；??６）?４天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。??Ｂ药筛法测定滴度??１－５步骤与“突光法测定滴度”相同，感染后７２?ｈ加入抗性药物ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，??持药物浓度５卩ｇ／ｍｌ。继续培养１天，观察细胞生长状况。??病毒样品稀释说明：??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cyclooxygenase 2 in liver dysfunction and carcinogenesis: Facts and perspectives[J]. Paloma Martín-Sanz,Marta Casado,Lisardo Boscá. World Journal of Gastroenterology. 2017(20)
[2]siRNA抑制HMGA1基因表达对LX-2细胞生物学功能的影响[J]. 胡蕾,刘莉,张霜,杜芳腾,张吉翔. 重庆医学. 2016(17)
[3]反义Ⅰ型转化生长因子β受体和反义TIMP-1联合作用对大鼠肝纤维化的抑制作用[J]. 李紫琼,木尼拉,高峰. 实用肝脏病杂志. 2015(01)
[4]RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究[J]. 姜晓笛,李智伟. 中国医学工程. 2013(05)
[5]RNA干扰技术的研究进展[J]. 徐俊,毛颖,苗荻,郝佳. 生物技术世界. 2012(03)
[6]pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定[J]. 俞艳萍,张松,孔维佳. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2010(17)
[7]siRNA靶向Rac1真核表达载体的构建与效应检测[J]. 张美霞,吴静,辛梅,李娟娟,张军军,严密. 四川大学学报(医学版). 2009(06)
[8]shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达[J]. 李刚,李湘平,姜立,鲁娟,刘雄,陈顺金. 南方医科大学学报. 2009(06)
[9]环氧合酶2与非酒精性脂肪性肝病[J]. 薛翠芳,赵和平. 国际内科学杂志. 2008(08)
[10]Expression of cyclooxygenase-2 and its pathogenic effects in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Mingbo Cao,Lei Dong,Xiaolan Lu,Jinyan Luo Department of Gastroenterology,Second Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an,Shaanxi 710004,China. Journal of Nanjing Medical University. 2008(02)
博士论文
[1]RNAi沉默COX-2对HSC细胞动力学及脂质代谢的影响[D]. 阳学风.南华大学 2012
[2]炎症反应及PKA/CREB信号途径介导帕瑞昔布脑保护机制的探讨[D]. 王娜.中南大学 2011
[3]纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D]. 胡平方.第二军医大学 2010
[4]RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达的实验研究[D]. 主余华.山东大学 2006
硕士论文
[1]pPB多肽介导的肝纤维化靶向siRNA稳定核酸脂质纳米粒研究[D]. 皮玉芳.华东师范大学 2016
[2]TGF-β siRNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白的影响[D]. 孙银春.重庆医科大学 2012
本文编号：2949731
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１?ＲＮＡｉ慢病毒载体构建实验流程??Ｆｉｇ．?１－１?ＲＮＡｉ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ??．
针对大鼠Ｃ０Ｘ－２基因ｓｈＲＮＡ慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）栽体的构建及鉴定??心ｌｍｉｎ，弃下层废液；??６００）ｉｌ预先配置好的漂洗液，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃下层废０００?ｒｐｍ空离２?ｍｉｎ，进一步除去残留的漂洗液；??净台中将回收柱转移至新的１．５?ｍｌ?ＥＰ管中，静置１０？２０?ｍｉｎ，收柱中加入９５?｜ｉｌ?Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ?Ｗａｔｅｒ，静置２?ｍｉｎ，１２０００?ｒｐｍ品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。??与质量检测??
１）测定前一天，使用２９３Ｔ贴壁细胞铺板，９６孔板，每孔４ｘｌ〇个细胞，体积??００?＾１；??２）根据病毒的预期滴度，准备７？１０个无菌的ＥＰ管，每管中加入９０?０无血清??养基；??３）取待测定的病毒原液１０＃加入到第一个管中，混匀后，取１０?ＩＩ伽入到第??个管中，继续相同的操作直到最后一管；??４）选取所需的细胞孔，弃去９０?４培养基，加入９０?０稀释好的病毒溶液，培??箱培养；５）２４?ｈ后，加入完全培养基１００?４，小心操作，不要吹起细胞；??６）?４天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。??Ｂ药筛法测定滴度??１－５步骤与“突光法测定滴度”相同，感染后７２?ｈ加入抗性药物ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，??持药物浓度５卩ｇ／ｍｌ。继续培养１天，观察细胞生长状况。??病毒样品稀释说明：??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cyclooxygenase 2 in liver dysfunction and carcinogenesis: Facts and perspectives[J]. Paloma Martín-Sanz,Marta Casado,Lisardo Boscá. World Journal of Gastroenterology. 2017(20)
[2]siRNA抑制HMGA1基因表达对LX-2细胞生物学功能的影响[J]. 胡蕾,刘莉,张霜,杜芳腾,张吉翔. 重庆医学. 2016(17)
[3]反义Ⅰ型转化生长因子β受体和反义TIMP-1联合作用对大鼠肝纤维化的抑制作用[J]. 李紫琼,木尼拉,高峰. 实用肝脏病杂志. 2015(01)
[4]RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究[J]. 姜晓笛,李智伟. 中国医学工程. 2013(05)
[5]RNA干扰技术的研究进展[J]. 徐俊,毛颖,苗荻,郝佳. 生物技术世界. 2012(03)
[6]pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定[J]. 俞艳萍,张松,孔维佳. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2010(17)
[7]siRNA靶向Rac1真核表达载体的构建与效应检测[J]. 张美霞,吴静,辛梅,李娟娟,张军军,严密. 四川大学学报(医学版). 2009(06)
[8]shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达[J]. 李刚,李湘平,姜立,鲁娟,刘雄,陈顺金. 南方医科大学学报. 2009(06)
[9]环氧合酶2与非酒精性脂肪性肝病[J]. 薛翠芳,赵和平. 国际内科学杂志. 2008(08)
[10]Expression of cyclooxygenase-2 and its pathogenic effects in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Mingbo Cao,Lei Dong,Xiaolan Lu,Jinyan Luo Department of Gastroenterology,Second Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an,Shaanxi 710004,China. Journal of Nanjing Medical University. 2008(02)
博士论文
[1]RNAi沉默COX-2对HSC细胞动力学及脂质代谢的影响[D]. 阳学风.南华大学 2012
[2]炎症反应及PKA/CREB信号途径介导帕瑞昔布脑保护机制的探讨[D]. 王娜.中南大学 2011
[3]纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D]. 胡平方.第二军医大学 2010
[4]RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达的实验研究[D]. 主余华.山东大学 2006
硕士论文
[1]pPB多肽介导的肝纤维化靶向siRNA稳定核酸脂质纳米粒研究[D]. 皮玉芳.华东师范大学 2016
[2]TGF-β siRNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白的影响[D]. 孙银春.重庆医科大学 2012
本文编号：2949731
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