小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备

发布时间：2021-01-16 11:58

　　目的1.克隆小鼠的TIM-3基因,建立原核表达载体。2.原核表达该分子,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法1.以BALB/c小鼠的脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3的胞外段序列,与pRSET-B载体连接。2.将pRSET-B-TIM-3质粒转入表达菌Roseeta（DE3）中,用IPTG诱导表达,利用western blot方法检测重组蛋白的抗原性。通过Ni-NTA柱的方法纯化重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、western blot,免疫组化和流式细胞术等方法检测抗体的效价与特异性。结果1.使用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠的脾细胞总RNA中扩增得到约510bp的TIM-3基因的胞外段,与pRSET-B载体连接,对重组体进行PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析表明:成功构建了原核表达载体pRSET-B-TIM-3。2.重组质粒的TIM-3蛋白在Rosseta（DE3）中经过IPTG诱导,以包涵体的形式高效表达。通过western blot分析,证实了约25KD的目的蛋白。3.用Ni-NTA镍柱纯化重组的TIM-3蛋白常... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

小鼠TIM-3RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文pMD18-T-TIM-3 重组质粒的 PCR 鉴定和双酶切鉴定结果：以转化 pMD18-T-TIM-3 重组质粒的菌液为模板，以 RT-PCR 的引物扩增出约片段，与 RT-PCR 扩增的片段大小一致，说明 pMD18-T-TIM-3 重组质粒构建 2-1）；pMD18-T-TIM-3 重组质粒经过 BamH I 和 Hind III 双酶切后，产生 2 个约为 900bp，另一个大于 2000bp，其中小的片段与前述 PCR 产物大小一目的片段已经正确插入 pMD18-T 载体（见图 2-2）。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文pMD18-T-TIM-3 重组质粒的 PCR 鉴定和双酶切鉴定结果：以转化 pMD18-T-TIM-3 重组质粒的菌液为模板，以 RT-PCR 的引物扩增出约片段，与 RT-PCR 扩增的片段大小一致，说明 pMD18-T-TIM-3 重组质粒构建 2-1）；pMD18-T-TIM-3 重组质粒经过 BamH I 和 Hind III 双酶切后，产生 2 个约为 900bp，另一个大于 2000bp，其中小的片段与前述 PCR 产物大小一目的片段已经正确插入 pMD18-T 载体（见图 2-2）。

【参考文献】：
期刊论文
[1]Current treatment indications and strategies in chronic hepatitis B virus infection[J]. George V Papatheodoridis,Spilios Manolakopoulos,Athanasios J Archimandritis.  World Journal of Gastroenterology. 2008(45)



本文编号：2980787