基于电泳和再测序芯片的腹泻症候群检测方法的建立及初步应用

发布时间：2017-04-13 22:26

  本文关键词：基于电泳和再测序芯片的腹泻症候群检测方法的建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 感染性腹泻一般是由于致泻性病毒或者致泻性细菌感染引起的,对于发展中国家来说,腹泻是严重的健康问题。由于腹泻的症状大致相同,仅根据患者的临床表现和流行病学特征无法准确的判断出相应的病原体。传统的腹泻病原体诊断方法包括电子显微镜法,培养法和酶联免疫吸附法。然而这些传统的方法不仅费时费力,其灵敏度和特异性也都不够好。目前已经报道的文献当中,几乎没有在同一样本中同时检测腹泻细菌和病毒相关研究,然而为了为了揭示病原体之间的协同作用以及混合感染的临床相关性,同时检测细菌和病毒是很必要的。目前是市面上已有了同时检测腹泻细菌和病毒的商业化试剂盒Lumiex GPP和Seegene Diarrhea ACE,然而其高昂的价格和复杂的设备要求限制了这些方法在中国的省,市级疾控中心的推广应用。因此,我们亟需建立一套特异性好,灵敏度高,高通量的检测方案,一方面能够满足基层实验室常规大量的腹泻样本检测需求,另一方面能够检测常规方法无法检出的不明原因腹泻样本。 目的： 本研究建立了两种腹泻病原体检测方法。第一种方法时是基于全自动毛细管电泳或者琼脂糖凝胶电泳的一步法两管多重PCR方法,可以同时检测13种常见的腹泻病毒和腹泻细菌；第二种方法是基于新型再测序芯片的腹泻症候群检测方法,可以同时检测14种轮状病毒,7种杯状病毒(包括诺如病毒和札如病毒),8种星状病毒,28种肠道病毒和16种不常见的致泻病毒。 方法： 对于两管法PCR,病毒管(V管)可以同时检测6种常见的腹泻病毒,包括A组轮状病毒(rotavirusA, RVA);诺如病毒(noroviruses, NoVs)的GⅠ型和GⅡ型；人类星状病毒(human astrovirus， HAstV);肠道腺病毒(enteric adenoviruses, EAds)以及人类博卡病毒(human bocavirus, HBo V);细菌管(B管)可以同时检测7中致泻细菌,包括沙门氏菌(Salmonella),副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus),致泻性大肠杆菌{diarrheogenic Escherichia coli),空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni),志贺氏菌(Shigella),耶尔森菌(Yersinia)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。在再测序芯片方法中,将所有特异性引物分成A、B、C、D、E和F六组分别放在6个反应管内,每个反应体系内分别加入一对内参基因的引物和一对相同的通用引物。两管法和芯片法的特异性都由阳性的临床样本进行检测,而灵敏度则使用10倍梯度稀释的体外转录RNA,重组质粒或者定量的菌液来测定。通过调整腹泻再测序芯片内参的浓度,摸索了最为合理的阳性判定阈值,同时优化了肠道病毒的检测步骤。使用了122份腹泻样本对方法进行临床评估,首先用两管一步法PCR对所有样本进行筛查,然后从其中的阴性样本中随机挑选出10份不明原因样本使用再测序芯片方法进行筛查。 结果： 两管法和RPM法的对于病毒的灵敏度都能达到20-200拷贝,对细菌则能检测到浓度为102-103CFU/mL。从临床样本的评估结果看来,两管法与参考方法没有显著差异。而再测序芯片的临床检测灵敏度更高,从10份不明原因的腹泻样本中检测出6例阳性样本。 结论： 成功建立一步法两管多重RT-PCR同时检测13腹泻病原体的快速、经济、高灵敏度、高特异性、高通量的新技术,有助于提高我国对腹泻病原体的常规监测能力,增强对腹泻传染病暴发的应急检测能力；成功建立了基于RPM-IVDC的腹泻症候群检测方法,再测序芯片的再测序和高通量优势在公共卫生领域有广阔的应用前景,为提高我国应对突发传染病的能力和控制传染病的流行有重要意义。
【关键词】：腹泻 病毒 细菌 Qiaxcel 再测序芯片
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 中英文缩写一览表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-21
• 第一部分 基于电泳的两管一步法多重PCR技术的建立及初步应用21-39
• 1 实验材料22-24
• 1.1 阳性参考样本22-23
• 1.2 临床样本23-24
• 1.3 所用试剂24
• 1.4 软件24
• 1.5 所用仪器及耗材24
• 2 实验方法24-30
• 2.1 引物24-26
• 2.2 标本采集与核酸提取26
• 2.3 标准品的制备26-27
• 2.4 多重检测体系的建立27-29
• 2.5 多重检测体系的特异性29-30
• 2.6 多重检测体系的灵敏度30
• 2.7 临床样本检测30
• 2.8 数据分析30
• 3 结果30-34
• 3.1 特异性30-32
• 3.2 灵敏度32
• 3.3 临床样品检测结果32-34
• 4 讨论34-39
• 第二部分 基于再测序芯片的腹泻症候群将检测技术的建立及初步应用39-56
• 1 实验材料40-41
• 1.1 阳性参考样本40
• 1.2 临床样本40
• 1.3 试剂40-41
• 1.4 软件41
• 1.5 仪器与耗材41
• 2 实验方法41-50
• 2.1 引物41-48
• 2.2 标本采集与核酸提取48
• 2.4 多重检测体系的建立48-50
• 2.5 RPM的特异性50
• 2.6 RPM的灵敏度50
• 2.7 临床样本检测50
• 3 结果50-52
• 3.1 特异性50-51
• 3.2 灵敏度51
• 3.3 不明原因样本检测结果51-52
• 4 讨论52-56
• 全文总结56-57
• 创新性57-58
• 参考文献58-65
• 附录 RPM-IVDC4-2检测腹泻症候群SOP65-71
• 综述 基因芯片在病原体检测方面的应用71-79
• 参考文献76-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士研究生期间完成的论文80-82
• 个人简历82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：304638