维生素D对细菌诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响及机制研究

发布时间：2017-04-16 08:27

  本文关键词：维生素D对细菌诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研究维生素D（Vitamin D, VD）对鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium诱导的小鼠溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）的影响，并初步探讨其可能的作用机制，为维生素D的临床应用及UC的营养治疗奠定理论基础。 方法：将40只3w龄雌性C57BL/6小鼠按体重随机分为正常组、模型组、VD缺乏组、低剂量VD补充组、高剂量VD补充组，共5组。给予正常组和模型组富含VD的正常饲料在正常光照下喂养，其余三组在不含紫外线的黄光灯照射下给予VD缺乏的饲料喂养。7w后，尾静脉采血，检测小鼠血清中25-OH-D3和钙离子的含量。VD缺乏模型建立后，，小鼠禁食4h，除正常组外，每只小鼠给予7.5mg/ml的链霉素溶液0.1ml灌胃，正常组给予等量无菌水溶液。链霉素处理20h后，小鼠再次禁食4h，正常组给予0.1ml无菌Luria-Bertani（LB）溶液灌胃，其余四组每只小鼠给予等量含1×106CFU Salmonellatyphimurium的LB溶液灌胃，继续禁食2h后，自由饮水摄食。实验期间密切监测小鼠体重、精神状态、粪便性状等。3d后，低剂量VD补充组和高剂量VD补充组分别给予1μg/kg、10μg/kg的1,25(OH)2D30.1ml灌胃，其余三组给予等量溶剂：含0.12%乙醇的磷酸盐缓冲液，连续3d后禁食24h处死。采集小鼠血清、结肠并无菌地取出肝脏和脾脏。评价各组小鼠的体重变化、肝脾重量、结肠的长度与重量、组织学损伤，HE染色后观察结肠组织的炎症程度等；酶联免疫吸附法检测小鼠血清中25-OH-D3，1,25(OH)2D3，白介素（Interluekin, IL）-17和IL-23的含量；微板法检测血清钙离子浓度；微生物平板计数法测定肝脾中沙门氏菌负荷；免疫组织化学法检测小鼠结肠组织维生素D受体（Vitamin D receptor, VDR）蛋白表达；Real-time PCR法检测小鼠结肠组织中核因子-κB（Nuclear factor, NF-κB）p65，IL-17和VDR mRNA表达水平。 结果： 1.维生素D缺乏小鼠模型成功建立，在黄光灯照射下喂养VD缺乏饲料的小鼠在第7w时血清25-OH-D3水平，显著低于正常喂养的小鼠（P0.001）。 2. Salmonella typhimurium处理的小鼠精神萎靡不振，体重下降明显（P0.05），部分出现粘液便和血便；肉眼大体损伤评分增加（P0.05），可见充血和溃疡等损伤；HE染色显示粘膜受损、上皮细胞丢失、粘膜下水肿、中性粒细胞浸润等，病理组织学评分显著增加（P0.05）；结肠长度变短，结肠湿重指数增加（P0.05）。 3. VD缺乏组HE染色显示结肠粘膜结构严重破坏，病理组织学评分均高于模型组（P0.05）；与VD缺乏组相比，低剂量VD补充可显著降低体重损失（P0.05）、结肠长度损失（P0.01）和病理组织学评分（P0.05）；而高剂量VD补充组病理组织学评分与VD缺乏组无差异（P0.05）。 4.模型组和VD缺乏组小鼠肝脾体积增大，呈暗红色，质量高于正常组（P0.01），肝脏和脾脏内Salmonella typhimurium细菌负荷增加（P0.05）；低剂量VD补充组肝脾重低于模型组和VD缺乏组，细菌负荷减少（P0.05）；高剂量VD补充组无改善（P0.05）。 5. VD缺乏组小鼠血清25-OH-D3和1,25(OH)2D3水平低于正常组和模型组（P0.05），低剂量VD补充组高于VD缺乏组（P0.01），与正常组无差异，高剂量VD补充组高于正常组（P0.01）。 6.与正常组相比，模型组和VD缺乏组血清IL-17和IL-23蛋白含量均增加（P0.01），且VD缺乏组水平较模型组高（P0.01）；低剂量和高剂量VD补充组IL-17和IL-23水平明显降低（P0.01），且高剂量组最低。 7.模型组和VD缺乏组小鼠结肠组织IL-17A，NF-κB p65和VDR mRNA表达水平较正常组明显增加（P0.01）；低剂量和高剂量VD补充组可显著降低其表达水平（P0.01），且高剂量VD补充组IL-17A，NF-κB p65和VDR mRNA表达均低于低剂量VD补充组的表达（P0.01）。 8.模型组VDR蛋白表达高于正常组（P0.01），VD缺乏组结肠组织VDR蛋白的表达水平显著低于模型组（P0.01）；低剂量和高剂量VD补充组VDR蛋白表达高于VD缺乏组（P0.01），且高剂量组较高。 结论： 1.成功建立Salmonella typhimurium诱导的小鼠实验性结肠炎。 2.维生素D缺乏的小鼠炎症因子的表达增加，肠道Salmonella typhimurium细菌负荷增加，加剧肠道炎症。 3.低剂量补充维生素D后能明显改善小鼠结肠炎症状，降低结肠炎症，减少肠道和肝脾中Salmonella typhimurium的含量；而高剂量补充维生素D结肠炎症并未得到改善，可能与过度抑制炎性因子的表达有关。 4.补充活性维生素D后，VDR蛋白含量和mRNA表达水平升高。 5.维生素D对细菌诱导的结肠炎的调节可能与VDR介导的对NF-κB的抑制作用有关。
【关键词】：维生素D 溃疡性结肠炎 维生素D受体 鼠伤寒沙门氏菌 NF-κB p65 IL-17
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 中英文缩写词对照表10-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-23
• 1. 实验动物14
• 2. 实验试剂与仪器14-15
• 2.1 主要试剂14
• 2.2 主要仪器14-15
• 3. 实验方法15-22
• 3.1 实验饲料与培养基15-16
• 3.2 实验动物分组16
• 3.3 维生素 D 缺乏模型制备16
• 3.4 动物 UC 模型制备和活性维生素 D 干预16
• 3.5 样品采集及指标测定16-17
• 3.6 指标评价与方法17-22
• 4. 统计学处理22-23
• 结果23-30
• 1. VD 缺乏小鼠模型成功建立23
• 2. 小鼠一般状况23-24
• 3. 结肠大体损伤形态学评分及小鼠结肠长度的变化24-25
• 4. 结肠组织病理学损伤评分25
• 5. 小鼠肝脏和脾脏质量及细菌负荷25-26
• 6. 小鼠血清钙和维生素 D 浓度26-27
• 7. 小鼠血清 IL-17 和 IL-23 表达水平变化27-28
• 8. 小鼠结肠组织 mRNA 表达28-29
• 9. 小鼠组织 VDR 蛋白表达29-30
• 讨论30-37
• 1. 沙门氏菌诱导的结肠炎模型的建立30-31
• 2. IL-23/IL-17 信号通路与溃疡性结肠炎31-33
• 3. 维生素 D 通过 VDR 作用于溃疡性结肠炎33-34
• 4. NF-κB p65 在溃疡性结肠炎炎症反应中的作用34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-44
• 综述44-53
• 参考文献49-53
• 个人简介及攻读学位期间研究成果53-54
• 致谢54

【参考文献】

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本文编号：310437