脂筏在CB2受体介导的内源性大麻素AEA抑制大鼠肝星状细胞增殖活性中的作用

发布时间：2021-04-11 09:32

　　目的探讨脂筏在内源性大麻素受体2（CB2）介导的内源性大麻素（AEA）抑制大鼠肝星状细胞（HSC）增殖活性中的作用及作用机制。方法构建大麻素受体2shRNA（Cnr2-shRNA）转染HSC细胞,干扰CB2受体的表达,采用MTT法检测转染前后不同浓度的AEA和甲基-β-环糊精（MCD）对HSC的作用效应;采用Western blot检测不同浓度AEA及MCD作用后HSC中P38丝裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）和c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶（p-JNK）的表达量;采用激光共聚焦法检测HSC上的脂筏（LRs）以及CB2受体的表达;蔗糖密度梯度离心法提取脂筏,Westernblot鉴定脂筏并检测脂筏中CB2受体的表达。结果成功构建Cnr2-shRNA转染筛选Cnr2-单克隆细胞株,MTT检测发现转染后CB2受体的减少能减弱AEA对HSC细胞增殖的抑制作用,然而用MCD预处理HSC细胞后CB2受体的减少对AEA的效应无明显影响。p-P38MAPK和p-JNK的表达与AEA浓度有依赖关系,且可以被MCD部分拮抗。CB2受体在HSC膜脂筏和胞质中均有表达,但用蔗糖密度梯度离心法提... 

【文章来源】：华中科技大学学报(医学版). 2012,41(02)北大核心CSCD

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【部分图文】：

图１荧光显微镜下观察转染前后ＨＳＣ（×５０）

ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ图１荧光显微镜下观察转染前后ＨＳＣ（×５０）Ｆｉｇ．１ＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＨＳＣｕｎｄｅｒｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（×５０）１：Ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ；２：ＣｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｍｐｔｙｐｌａｓｍｉｄｓｐＧｅｎｅｓｉｌ－３；３：ＣｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ图２Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞转染前后ＣＢ２受体的表达Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＢ２ｉｎＨＳＣｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ２．２脂筏在ＡＥＡ通过ＣＢ２受体抑制ＨＳＣ细胞增殖中的作用ＭＴＴ法检测ＭＣＤ去除脂筏前后不同浓度的ＡＥＡ对ＨＳＣ增殖的影响，发现ＭＣＤ本身对ＨＳＣ细胞增殖无影响，却抑制了ＡＥＡ对ＨＳＣ细胞的增殖抑制作用（ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ组ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ组以及ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌｖｓ．ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌ组差异均有统计学意义）（表１），提示脂筏介导了ＡＥＡ对ＨＳＣ增殖的影响。然而，转染ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ后，ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ处理组ＭＣＤ处理前后ＡＥＡ的抑制效应无明显差异，提示ＣＢ２受体减少后，ＭＣＤ对ＡＥＡ的抑制增殖效应的影响明显减弱（转染ｐＧｅｎｅｓｉｌ－３－Ｃｎｒ２－ｓｈＲＮＡ组ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ组ｖｓ．ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＡＥＡ２０

０１］。ＭＣＤ可以部分抑制它们的激活［ｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫ／β－ａｃｔｉｎ：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（１．１４±０．０１）ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ（１．６３±０．０６），ｔ＝１２．９，Ｐ＝０．００５；ｐ－ＪＮＫ／β－ａｃｔｉｎ：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（１．１０±０．１９）ｖｓ．ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ（１．６７±０．２１），ｔ＝３．５，Ｐ＝０．０２５］（图３）。１：ＡＥＡ５μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；２：ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；３：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ；４：ＡＥＡ２０μｍｏｌ／Ｌ＋ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ图３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测不同浓度的ＡＥＡ和ＭＣＤ处理后ｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫ和ｐ－ＪＮＫ活性Ｆｉｇ．３Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐ－Ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄｐ－ＪＮＫｉｎＨＳＣｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＡＥＡａｎｄＭＣＤ２．４脂筏和ＣＢ２受体在ＨＳＣ细胞中的定位将细胞分别予以ＡＥＡ０μｍｏｌ／Ｌ、ＭＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ和ＡＥＡ１０μｍｏｌ／Ｌ处理后，激光共聚焦法检测脂筏和ＣＢ２受体在细胞中的亚定位。如图４Ａ２、４Ｃ３，绿色荧光蛋白（Ａｌｅｘａ４８８－ＣＴＸ）代表脂筏，提示了ＨＳＣ细胞中脂筏的聚集，胆固醇膜耗竭剂ＭＣＤ处理后，细胞膜上绿色荧光蛋白明显减少（图４Ｂ２、４Ｃ２）。如图４Ｃ４所示，红色荧光代表ＣＢ２受体，它既存在于脂筏中，也存在


本文编号：3131011