核糖核酸内切酶Ⅲ制备的HBV小干扰RNA（esiRNA）文库对乙肝病毒感染的基因治疗
发布时间：2021-05-28 11:09
研究目的：建立HBV esiRNA文库制备技术；研究该文库对HepG2.215细胞内HBV表面抗原（HBsAg）表达的抑制效应。研究方法：1,GST-大肠杆菌核糖核酸内切酶Ⅲ（GST-RNaseⅢ）融合蛋白的纯化构建RNaseⅢ重组载体pGEX-KG-RNaseⅢ.将由乳糖操纵子控制的GST-RNaseⅢ表达质粒pGEX-KG-RNase;Ⅲ转化大肠杆菌BL-21（DE3）,挑取单克隆,大量培养并用乳糖类似物IPTG诱导该蛋白表达。收集大量培养的诱导菌株,裂解并应用GST-琼脂糖凝胶珠亲和层析分离GST-RNaseⅢ.应用透析法纯化GST-RNaseⅢ2,HBV基因组序列1～540核苷酸（HBV-1）的双向转录模板（T7-HBV-1）以及其转录产物制备及鉴定设计针对HBV-1并的5’端均含有T7启动子的引物,并通过PCR体外扩增得到T7-HBV-1 DNA。应用T7 RNA聚合酶体外转录该模板,同时将转录后产物退火,并鉴定产物为双链RNA（dsRNA）,即T7-HBV-1 dsRNA。3, GST-RNaseⅢ酶活性检测以及反应条件的优化和T7-HBV-1小干扰RNA（T7-HBV-1...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GST-RNaselH蛋白诱导及纯化
indueedBL21(DE3)lysate;2，GST一RNaselllixlthesul)erzlatantofGST一be。。15elutedbyred、，eing9lu士at卜liollesolotioxl:3，GST一RNaselllafterdialysis:beads，GST一RNas。川z、emair:ix飞91一1theelotedbeads:l口g、2尽g、4“9BSAtoidel:tifytheGST一RNaseIJIeo，:ec:、，z士i，atiolz.3.3T7一HBVeslON^扩增与dsRN^产物分析及鉴定1.5%琼脂糖凝胶电泳分析体外扩增T7一HBV一1DNA产物以及纯化得到目的片段大小在500一75Obp之I句，与理论大小(586bp)一致(图ZA，B)。T7一HBV一1DNA体外转录产物经退火之后进行产物鉴定:DNasel处理之后，产物条带跟无处理组相比较没有变化，说明产物不是DNA;DNasel与RNaseA处理后条带亮度跟对照相似，说明产物不是单链RNA;产物加入RNaseA95℃水浴IOmin处理后，迅速冰浴以保持产物单链状态和保证RNaseA的活性并处理lh，条带有部分降解，说明产物可以解成单链的RNA而被RNaseA降解，所以最终产物是双链RNA(命名为T7一HBV一1dSRNA)(图ZC)。MT7一HBV一1
图440fo低熔点琼脂糖凝胶TBE电泳检测T7一HBVesiRNAA:GST一RNase川酶活队检测以及反应条件的优化1.2p9GST一RNaselll于20pl酶反J位体系，37℃水浴中分别作用酶切丁71dSRNAI时间为0.5、1、1.5和Zh。B:纯化的T7一HBV一1esiRNA及土〔’、siRNA)\小对比。Fig.4Eleeti、opho]一esisofIIB、eSIR入Alib工al，y011准%low12一。1飞1119agal、osege]11飞TBEIJllffezlA:GST一RXaselllaetivitiesassayandoptimizationofl，eaetioneonditiol飞.Digestio一15werepel，foz一Inedusixlg1.2以9GST一RNaseT丁112120，1ofl、eaetiol〕solutiollat370Cfor0.5、1.0、1.5and2hours.B:Sizeeo一npai、isorlofPux，ifiedT7一I一IBV一1esiRXAwithehemiealsyllt}zesized5iRNA.3.5T7一HBVesles1RNA效应检测通过HBV基因组与HBV一1序列对比模式图分析T7一I侣V--1esiRNA文库在IIBV基因组的作用靶区，发现该文库与11BSAg开放阅读框架部分重叠(见图4A)。所以
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J]. Zhi-Kang Qian, Bao-Qin Xuan, Tai-Shan Min, Jian-Feng Xu, Lin Li, Wei-Da Huang, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Fudan University, 220 Handan Road, Shanghai 200433, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(09)
本文编号：3208148
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GST-RNaselH蛋白诱导及纯化
indueedBL21(DE3)lysate;2，GST一RNaselllixlthesul)erzlatantofGST一be。。15elutedbyred、，eing9lu士at卜liollesolotioxl:3，GST一RNaselllafterdialysis:beads，GST一RNas。川z、emair:ix飞91一1theelotedbeads:l口g、2尽g、4“9BSAtoidel:tifytheGST一RNaseIJIeo，:ec:、，z士i，atiolz.3.3T7一HBVeslON^扩增与dsRN^产物分析及鉴定1.5%琼脂糖凝胶电泳分析体外扩增T7一HBV一1DNA产物以及纯化得到目的片段大小在500一75Obp之I句，与理论大小(586bp)一致(图ZA，B)。T7一HBV一1DNA体外转录产物经退火之后进行产物鉴定:DNasel处理之后，产物条带跟无处理组相比较没有变化，说明产物不是DNA;DNasel与RNaseA处理后条带亮度跟对照相似，说明产物不是单链RNA;产物加入RNaseA95℃水浴IOmin处理后，迅速冰浴以保持产物单链状态和保证RNaseA的活性并处理lh，条带有部分降解，说明产物可以解成单链的RNA而被RNaseA降解，所以最终产物是双链RNA(命名为T7一HBV一1dSRNA)(图ZC)。MT7一HBV一1
图440fo低熔点琼脂糖凝胶TBE电泳检测T7一HBVesiRNAA:GST一RNase川酶活队检测以及反应条件的优化1.2p9GST一RNaselll于20pl酶反J位体系，37℃水浴中分别作用酶切丁71dSRNAI时间为0.5、1、1.5和Zh。B:纯化的T7一HBV一1esiRNA及土〔’、siRNA)\小对比。Fig.4Eleeti、opho]一esisofIIB、eSIR入Alib工al，y011准%low12一。1飞1119agal、osege]11飞TBEIJllffezlA:GST一RXaselllaetivitiesassayandoptimizationofl，eaetioneonditiol飞.Digestio一15werepel，foz一Inedusixlg1.2以9GST一RNaseT丁112120，1ofl、eaetiol〕solutiollat370Cfor0.5、1.0、1.5and2hours.B:Sizeeo一npai、isorlofPux，ifiedT7一I一IBV一1esiRXAwithehemiealsyllt}zesized5iRNA.3.5T7一HBVesles1RNA效应检测通过HBV基因组与HBV一1序列对比模式图分析T7一I侣V--1esiRNA文库在IIBV基因组的作用靶区，发现该文库与11BSAg开放阅读框架部分重叠(见图4A)。所以
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J]. Zhi-Kang Qian, Bao-Qin Xuan, Tai-Shan Min, Jian-Feng Xu, Lin Li, Wei-Da Huang, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Fudan University, 220 Handan Road, Shanghai 200433, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(09)
本文编号：3208148
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