间充质干细胞与shRNA联合治疗肝损伤的研究

发布时间：2017-04-23 04:00

  本文关键词：间充质干细胞与shRNA联合治疗肝损伤的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性肝炎可以造成肝细胞损伤。肝纤维化的形成是由于受到多种细胞因子的刺激,肝内星状细胞被激活,肝细胞外基质大量合成,以致纤维组织的大量沉积。HBV自身并不会对肝脏造成损伤,引起肝细胞损伤的主要原因是宿主特异性免疫应答,细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)不仅可以清除HBV,还可以杀伤感染后的肝细胞。 在本论文中联合RNA干扰和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植技术共同治疗肝损伤。RNA干扰(RNA interference, RNAi)通过小干扰RNA (siRNA)诱导转录后水平上的基因沉默,为有效的治疗HBV感染提供了新方法。在国内外的文献中,有关利用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒复制的报道已屡见不鲜。然而,对于中后期慢性乙肝病毒感染的患者来说,虽然体内乙肝病毒的复制被抑制,但肝损伤程度很严重,肝细胞已经不能进行自我修复。这样一来,仅使用RNA干扰技术并不能达到良好的治疗效果。间充质干细胞来源广泛,取材方便,无免疫原性,据报道无论在体内还是体外都有向肝细胞分化的潜能,并可以迁移到受伤的肝组织进行修复,移植后间充质干细胞分泌的一些细胞因子也可以帮助宿主恢复肝损伤,由此,MSCs是肝移植的理想供体。 我们一方面通过靶向性的小发夹RNA (small hairpin RNA, shRNA)抑制乙型肝炎病毒在鼠体内的复制：同时,又通过脾内注射移植间充质干细胞以修复模型鼠的肝损伤。这样,既抑制了乙型肝炎病毒的复制又改善了肝损伤的程度。 首先我们查阅中外文献选择了不同的HBV DNA靶点,Lx-shRNA157是以HBV DNA基因组S开放式阅读框157i为靶点设计的shRNA表达质粒,Lx-shRNA1694是以HBV DNA基因组X开放式阅读框1694i为靶点设计的shRNA表达质粒,Lx-shRNA157-1694为双靶点shRNA表达质粒。我们合成的三个shRNA表达质粒无论在体内还是体外对HBV的复制都有较好的抑制效果,并且双靶点Lx-shRNAl57-1694对HBV复制的抑制效果都要好于单靶点。 其次我们在体外通过特殊培养基的诱导分化,成功将人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUC-MSCs)和小鼠永生型间充质干细胞(mouse immortal mesenchymal stem cells, mi-MSCs)分化为成骨细胞和成肝细胞。并证明了向成肝细胞分化后的MSCs具有成熟肝细胞的功能,如：糖原的贮存,尿素的合成等。 乙型肝炎研究困难是因为HBV的宿主范围狭窄,很难找到合适的动物模型。最后我们结合尾静脉高压注射法和CCl4诱导法成功构建了乙肝病毒肝脏纤维化小鼠模型,使鼠体内既有HBV的复制又有肝纤维化的存在,以模拟慢性HBV感染患者体内的环境。我们联合shRNA和MSCs移植技术治疗肝损伤,shRNA可以靶向性地抑制HBV的复制,MSCs可以修复受损伤的肝组织。通过ELISA、蛋白质免疫印迹法和RT-PCT检测乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen, HBsAg)和乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e Antigen, HBeAg)的含量,研究结果表明靶向性shRNA确实可以显著降低HBsAg和HBeAg的水平,抑制率可达95%以上。通过天狼星红染色、肝重／体重以及谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量的测定检测肝细胞纤维化的程度。通过糖原染色和尿素氮含量的测定以检测肝功能恢复的程度。研究结果表明移植MSCs确实对肝损伤有一定的改善作用,移植后的肝脏基本可以恢复正常的肝功能。 本文通过以上实验验证了shRNA和MSCs的作用与功能。将两种技术相结合可以更加有效地治疗由HBV感染所致的肝损伤,这为HBV感染的治疗提供了新的治疗策略。
【关键词】：乙型肝炎病毒 肝损伤 间充质干细胞 小发夹RNA
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-23
• 1.1 HBV概述12-16
• 1.1.1 HBV形态结构12-13
• 1.1.2 HBV基因结构特点13-14
• 1.1.3 HBV侵入人体的机制14-15
• 1.1.4 病毒性肝炎的发病机理及肝损伤的形成15-16
• 1.2 RNA干扰概述16-17
• 1.3 MSCs概述17-19
• 1.4 动物模型19-21
• 1.5 本文的立体依据21-23
• 第2章 材料与方法23-37
• 2.1 实验材料与常规试剂23-26
• 2.1.1 HBV基因靶点的选择及质粒的构建23-24
• 2.1.2 抗体24
• 2.1.3 常规试剂的配制方法24-26
• 2.2 仪器和设备26-27
• 2.3 方法与相关试剂27-37
• 2.3.1 大肠杆菌(DH5α)感受态的制备27-28
• 2.3.2 细胞培养及转染28-29
• 2.3.3 免疫印迹法29
• 2.3.4 ELISA法29
• 2.3.5 MSCs向成骨细胞分化29-30
• 2.3.6 MSCs向肝细胞分化30-31
• 2.3.7 茜素红染色31
• 2.3.8 RT-PCR31-33
• 2.3.9 肝糖原检测33
• 2.3.10 尿素含量检测33-34
• 2.3.11 尾静脉高压注射法建立急性乙型肝炎小鼠模型34
• 2.3.12 CCl_4肝损伤小鼠模型的建立34-35
• 2.3.13 乙肝病毒肝脏纤维化小鼠模型35
• 2.3.14 小鼠脾内移植MSCs35
• 2.3.15 AST、ALT含量的测定35-36
• 2.3.16 天狼星红染色36-37
• 第3章 结果与讨论37-64
• 3.1 shRNA表达载体体外抑制HBV复制及表达37-43
• 3.1.1 质粒的构建37-38
• 3.1.2 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达38-40
• 3.1.3 shRNA对HBV mRNA的降解作用40-41
• 3.1.4 小结41-43
• 3.2 shRNA表达载体体内抑制HBV复制及表达43-48
• 3.2.1 尾静脉高压注射法注射结果43-44
• 3.2.2 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达44-46
• 3.2.3 shRNA表达载体在体内降解HBsAg mRNA46-47
• 3.2.4 天狼星红染色47-48
• 3.2.5 小结48
• 3.3 MSCs向成骨细胞分化48-50
• 3.3.1 茜素红染色49-50
• 3.3.2 小结50
• 3.4 MSCs向成肝细胞分化50-55
• 3.4.1 细胞形态变化51
• 3.4.2 分化过程中肝特异性蛋白的表达51-53
• 3.4.3 肝功能检测53-54
• 3.4.4 小结54-55
• 3.5 MSCs与shRNA联合治疗乙肝病毒肝脏纤维化小鼠55-64
• 3.5.1 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达56-58
• 3.5.2 肝重/体重58-59
• 3.5.3 ALT、AST含量检测59-60
• 3.5.4 天狼星红染色60-61
• 3.5.5 小结61-64
• 讨论64-66
• 结论66-67
• 参考文献67-70
• 致谢70-71
• 作者简介71

【共引文献】

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本文编号：321749