趋化因子CCL2及其受体CCR2，以及钙离子结合蛋白S100A11，S100A6调节肝脏再生功能的实验研究
发布时间：2021-10-19 15:00
肝脏是机体中最大的消化器官,也是体内新陈代谢的重要场所,同时肝脏也是机体唯一具有再生能力的器官。在正常情况下,绝大部分的肝细胞处于细胞周期的静息期,仅有0.001%0.01%的肝细胞在进行有规律的DNA复制。而当肝脏受到病理性损伤或者手术切除后,肝细胞便由原来的静息期进入G1期,从而进行有丝分裂,细胞大量增殖,最终恢复到受损前的大小,从而完成肝脏的再生。肝脏再生机制的研究对于肝脏再生能力丧失或受损病人的救治以及肝脏功能的恢复都具有十分重要的意义。目前认为肝脏再生过程中所必需的途径大致可归为细胞因子网络,生长因子网络和代谢网络等三个信号网络,三者相互作用,共同调控着肝脏再生这一复杂过程。当前对于肝脏再生机理的认识仍然是一个难题,当中的众多调控过程依然无法加以阐述。鉴于此,本次研究的目的在于筛选肝脏再生过程中新的功能基因,为肝脏再生的机理研究提供新的思路,为开发新的具有肝脏保护作用的药物,提供理论依据。本文的工作基础是运用基因芯片技术,得到了小鼠CCl4损伤模型下,基因组转录的变化情况。通过这一结果,我们从在肝损伤恢复过程中上调的基因中选取了四个基因的表达产物作为研究...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 肝脏再生
1.2 肝脏再生的分子机理
1.3 肝脏再生模型
1.4 趋化因子CCL2 及其受体CCR2
1.5 钙离子结合蛋白S100A11 和S100A6
1.6 论文的主要研究内容和创新点
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 常用试剂
2.2 实验仪器与设备
2.3 常用溶液的配制
2.3.1 常规溶液
2.3.2 SDS 碱裂解法大量制备质粒DNA 相关溶液
2.3.3 蛋白电泳相关溶液
2.3.4 Western blot 相关溶液
2.3.5 ELISA 相关溶液
2.3.6 HE 染色和免疫组织化学相关溶液
2.4 方法
2.4.1 肝脏组织总RNA 的提取
2.4.2 肝脏组织总cDNA 的合成
2.4.3 检测RT-PCR 的cDNA 质量
2.4.4 基因的克隆和表达载体的构建
2.4.5 大量制备高纯度的pcDNA3.1 以及插入外源基因的pcDNA3.1 重组质粒
2.4.6 高纯度质粒中内毒素的清除以及内毒素含量的测定
2.4.7 小鼠肝损伤模型
2.4.8 质粒电转染方法
2.4.9 小鼠血液和肝脏样品的采集
2.4.10 组织包埋程序
2.4.11 组织石蜡切片的制作
2.4.12 常规HE 染色步骤
2.4.13 PCNA 免疫组织化学
2.4.14 血清中谷丙转氨酶（ALT）活力的测定
2.4.15 重组蛋白的小量原核表达
2.4.16 重组蛋白的大量诱导表达
2.4.17 蛋白裂解处理方案
2.4.18 Glutathione Sepharose 48 纯化GST 融合蛋白及用Thrombin 酶解融合蛋白
2.4.19 Glutathione Sepharose 48 树脂的回收
2.4.20 Bradford 法测蛋白溶液浓度
2.4.21 多克隆抗体的制备
2.4.22 抗体纯化
2.4.23 Western blot 检测抗体效价
2.4.24 酶联免疫吸附实验（ELISA）
2.4.25 His-Select~(TM) Nichel Affinity Gel 亲和纯化融合蛋白
2.4.26 包涵体的变性和复性
第三章 结果
3.1 CCL2 及其受体CCR2 在肝再生过程中的作用
3.1.1 RT-PCR 获得cDNA
3.1.2 CCL2 真核表达载体的构建和鉴定
3.1.3 pcDNA-CCL2 质粒小鼠电转染实验结果
3.1.4 CCR2 氨基端55 个氨基残基多肽的原核表达载体的构建
3.1.5 CCR2_(Δ1-55) 的原核表达及纯化
3.1.6 CCR2_(Δ1-55) 多克隆抗体的制备
3.1.7 CCR2_(Δ1-55) 抗体阻断的实验结果
3.1.8 CCL2 原核表达载体的构建
3.1.9 CCL2 的原核表达及纯化
3.2 S100A11 在肝再生过程中的作用
3.2.1 S100A11 真核表达载体的构建和鉴定
3.2.2 pcDNA-S100A11 质粒小鼠电转染实验结果
3.2.3 S100A11 原核表达载体的构建
3.2.4 S100A11 的原核表达及纯化
3.3 S100A6 在肝再生过程中的作用
3.3.1 S100A6 真核表达载体的构建和鉴定
3.3.2 pcDNA-S100A6 质粒小鼠电转染实验结果
3.3.3 S100A6 原核表达载体的构建
第四章 讨论
第五章 结论和展望
5.1 本文研究总结
5.2 课题研究展望
参考文献
附录
附录1 克隆基因的开放阅读框序列
附录2 各种试剂盒使用步骤
附录3 pcDNA3.1，pGEX-4T-2 和pET-28 质粒图谱
致谢
攻读硕士学位期间发表或录用的论文
本文编号：3445095
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 肝脏再生
1.2 肝脏再生的分子机理
1.3 肝脏再生模型
1.4 趋化因子CCL2 及其受体CCR2
1.5 钙离子结合蛋白S100A11 和S100A6
1.6 论文的主要研究内容和创新点
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 常用试剂
2.2 实验仪器与设备
2.3 常用溶液的配制
2.3.1 常规溶液
2.3.2 SDS 碱裂解法大量制备质粒DNA 相关溶液
2.3.3 蛋白电泳相关溶液
2.3.4 Western blot 相关溶液
2.3.5 ELISA 相关溶液
2.3.6 HE 染色和免疫组织化学相关溶液
2.4 方法
2.4.1 肝脏组织总RNA 的提取
2.4.2 肝脏组织总cDNA 的合成
2.4.3 检测RT-PCR 的cDNA 质量
2.4.4 基因的克隆和表达载体的构建
2.4.5 大量制备高纯度的pcDNA3.1 以及插入外源基因的pcDNA3.1 重组质粒
2.4.6 高纯度质粒中内毒素的清除以及内毒素含量的测定
2.4.7 小鼠肝损伤模型
2.4.8 质粒电转染方法
2.4.9 小鼠血液和肝脏样品的采集
2.4.10 组织包埋程序
2.4.11 组织石蜡切片的制作
2.4.12 常规HE 染色步骤
2.4.13 PCNA 免疫组织化学
2.4.14 血清中谷丙转氨酶（ALT）活力的测定
2.4.15 重组蛋白的小量原核表达
2.4.16 重组蛋白的大量诱导表达
2.4.17 蛋白裂解处理方案
2.4.18 Glutathione Sepharose 48 纯化GST 融合蛋白及用Thrombin 酶解融合蛋白
2.4.19 Glutathione Sepharose 48 树脂的回收
2.4.20 Bradford 法测蛋白溶液浓度
2.4.21 多克隆抗体的制备
2.4.22 抗体纯化
2.4.23 Western blot 检测抗体效价
2.4.24 酶联免疫吸附实验（ELISA）
2.4.25 His-Select~(TM) Nichel Affinity Gel 亲和纯化融合蛋白
2.4.26 包涵体的变性和复性
第三章 结果
3.1 CCL2 及其受体CCR2 在肝再生过程中的作用
3.1.1 RT-PCR 获得cDNA
3.1.2 CCL2 真核表达载体的构建和鉴定
3.1.3 pcDNA-CCL2 质粒小鼠电转染实验结果
3.1.4 CCR2 氨基端55 个氨基残基多肽的原核表达载体的构建
3.1.5 CCR2_(Δ1-55) 的原核表达及纯化
3.1.6 CCR2_(Δ1-55) 多克隆抗体的制备
3.1.7 CCR2_(Δ1-55) 抗体阻断的实验结果
3.1.8 CCL2 原核表达载体的构建
3.1.9 CCL2 的原核表达及纯化
3.2 S100A11 在肝再生过程中的作用
3.2.1 S100A11 真核表达载体的构建和鉴定
3.2.2 pcDNA-S100A11 质粒小鼠电转染实验结果
3.2.3 S100A11 原核表达载体的构建
3.2.4 S100A11 的原核表达及纯化
3.3 S100A6 在肝再生过程中的作用
3.3.1 S100A6 真核表达载体的构建和鉴定
3.3.2 pcDNA-S100A6 质粒小鼠电转染实验结果
3.3.3 S100A6 原核表达载体的构建
第四章 讨论
第五章 结论和展望
5.1 本文研究总结
5.2 课题研究展望
参考文献
附录
附录1 克隆基因的开放阅读框序列
附录2 各种试剂盒使用步骤
附录3 pcDNA3.1，pGEX-4T-2 和pET-28 质粒图谱
致谢
攻读硕士学位期间发表或录用的论文
本文编号：3445095
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