非酒精性脂肪性肝病中Kupffer细胞激活方式的研究

发布时间：2017-05-04 12:04

  本文关键词：非酒精性脂肪性肝病中Kupffer细胞激活方式的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的： 近年来,随着社会经济水平的提高,人们生活方式的改变,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成为我国导致慢性肝病的重要原因之一。NAFLD包括一系列相互联系的病理改变,从单纯性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH),到肝纤维化、肝硬化,甚至可以进展为肝细胞癌。目前,NAFLD的发病机制尚不明确,随着人们对巨噬细胞在机体免疫及脂质稳态中的作用的了解不断增加,关于Kupffer细胞(Kupffer cells, KCs)与NAFLD发病机制关系的研究逐渐升温。KCs是定居于肝血窦的单核-巨噬细胞,能够在窦实质和脉管腔隙间迁移,在两者间建立联系。已有一些研究表明,在异常情况下,激活的KCs可通过产生多种生物活性介质如细胞因子、趋化因子、蛋白水解酶、ROS和NO等在多种肝损伤中起重要作用。CD4+T细胞可分为Th1和Th2两个亚群,Th1和Th2细胞分泌不同的细胞因子分别刺激KCs向两个方向激活,故相应的KCs存在两种表型,即M1型(经典激活巨噬细胞),M2型(选择性激活巨噬细胞)。M1型由促炎介质激活如IFN-γ,能诱导一些细胞因子释放(如IL-12, IL-6, TNF-α,IL-23)。M2型则被IL-4和IL-13等激活,参于组织的修复、组织纤维化和血管形成等。在NAFLD形成机制中,KCs在经典激活和选择性激活两种状态之间的转换可能影响NFALD的发病,目前尚未见文献做体内研究的扳道。本研究旨在通过体内实验的方法,探索KCs在NAFLD早期的激活方式变化。 方法： (1)小鼠非酒精性脂肪性肝病模型构建：将C57BL/6J雄性小鼠分为对照组和高脂模型组,分别饲养4周,8周,12周三个时间点,同时观察每个阶段小鼠的一般情况,检测血清肝功能指标,并固定部分肝组织做病理切片,留取部分肝组织按TG测定试剂盒说明书步骤测定肝中TG含量。饲养环境明暗各12小时,实验小鼠可自由进食和饮水,4只一笼饲养。 (2)小鼠肝脏原代KCs流式分选及评价：小鼠隔夜禁食麻醉后,采用胶原酶原位消化,肝离体后继续消化,细胞悬液以差速离心去除肝实质细胞(HC),非实质细胞通过密度梯度离心获得,KCs通过流式细胞仪,标记CD45-APC和F4/80-PE抗体进行分选纯化,CD45+F4/80+即为KCs。 (3) KCs的培养及油红O染色：用DMEM(H)培养基加10%胎牛血清加1%双抗(链霉素+青霉素)培养KCs,24h后吸弃培养基,用PBS轻柔漂洗后加入4%多聚甲醛固定15min,然后用油红稀释液染色15min,60%异丙醇漂洗后用苏木素复染5min,显微镜下观察并拍照。 (4) qRT-PCR检测：反应体系为：KCs的cDNA为模板,SYBR Green II为荧光染料,不同基因的引物(内参基因和待测基因),MiX (DNA聚合酶,四种脱氧核苷酸,缓冲溶液,内参染料),设置反应参数条件进行定量PCR,最后分析数据。 (5)流式分析对照组和模型组中KCs所占比列及表面标志物CD206：流式分析检测管中加入F4/80-PE和CD206-FITC抗体进行检测。 结果： (1)小鼠脂肪肝模型构建：与对照组相比,造模4周病变轻微,8周呈以小泡性为主的混合性脂肪变性,造模12周,肝细胞脂肪变性程度较8周时明显加重,肝细胞表现为大泡性脂肪变性,三个阶段肝小叶及汇管区都无炎症细胞浸润、肝细胞坏死和纤维化等其他组织学表现。肝中TG的含量随着造模时间延长也逐渐增加。 (2)流式细胞术分选KCs：细胞纯度可达95%以上。 (3)油红O染色：模型组细胞较对照组细胞变圆,核大,部分细胞核被挤到一侧,呈印戒样改变,胞浆内可见大量红染的脂滴。 (4)KCs的M1型和M2型标志物检测结果：M1型标志物TNF-α, IL-6,IL-12b水平显著上调,而M2型的标准物Arg-1, CD206水平显著下调,表明脂肪肝阶段,M1型KCs占优势。 (5)流式结果分析：模型组较对照组KCs细胞比例未发生显著变化,而M2型表面标志物CD206表达强度下降,与qRT-PCR结果相符。 结论： (1)单纯性脂肪肝阶段KCs并未通过增加数量发挥作用； (2)单纯性脂肪肝阶段KCs形态上发生变化：吞噬大量脂滴,呈现泡沫状； (3)单纯性脂肪肝阶段虽然炎症尚未发生,但KCs表型已呈现M1型优势,可能影响脂肪肝进一步发展。
【关键词】：非酒精性脂肪性肝病 Kupffer细胞 流式细胞术 表型
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 插图和附表清单12-13
• 缩略语表13-14
• 目次14-15
• 1 引言15-17
• 2 材料与方法17-25
• 2.1 实验材料17-19
• 2.2 实验方法19-25
• 3 结果25-35
• 3.1 小鼠非酒精性脂肪肝模型的构建及评价25-28
• 3.2 小鼠肝脏原代KCs分选结果分析评价28-31
• 3.3 脂肪肝发生后KCs的形态改变31
• 3.4 qRT-PCR检测KCs表型标志物31-33
• 3.5 流式细胞仪检测KCs表面CD206表达情况33-35
• 4 讨论35-40
• 5 结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-54
• 参考文献51-54
• 作者简历54

【共引文献】

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本文编号：345016