大黄素联合KGF与HIF-1α在低氧细胞应激损伤中的自噬机制研究

发布时间：2017-05-04 14:10

  本文关键词：大黄素联合KGF与HIF-1α在低氧细胞应激损伤中的自噬机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:采用传统中药提取物结合基因治疗的策略,用于保护低氧环境下损伤的肠粘膜,改善肠粘膜屏障的结构和功能。本实验以大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)为体外模型,使用大黄素联合低氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)和角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF),建立新的治疗方案,明确其在低氧所致肠应激损伤中通过细胞自噬机制起保护作用。方法:1.通过MTT法筛选大黄素最佳作用浓度;2.用携带GFP荧光蛋白基因的腺病毒转染IEC-6细胞,测定最佳转染复数(multiplicityofy infection,MOI);3.分为四组:对照组,细胞因子组(携带双基因HIF-1α和KGF组),大黄素组,大黄素联合细胞因子组(携带双基因HIF-1α和KGF联合大黄素组),各组分别作用相应药物;4.在低氧0小时、6小时、24小时分别MTT法检测细胞生存率、流式细胞仪检测细胞周期;5.在低氧6小时、24小时分别行透射电镜观察自噬体的出现、Real time-PCR检测自噬相关基因(Beclin-1、LC3)、Western-blot法检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3);6.携带HIF-1α和KGF两种基因的腺病毒转染IEC-6细胞,用Real time-PCR法、免疫荧光法、Western-blot蛋白印记法检测细胞因子组和大黄素联合细胞因子组在低氧0小时、6小时、24小时两种外源基因(HIF-1α、KGF)的表达。结果:1.大黄素在浓度为5μmol/L时具有明显促进细胞生长作用;2.根据携带GFP荧光蛋白基因的腺病毒转染IEC-6检测荧光表达率与相应MTT实验可得到腺病毒的最佳MOI为100;携带HIF-1α和KGF的腺病毒按照最佳转染复数转染IEC-6;3.MTT法可得出在低氧条件下,大黄素联合细胞因子组对IEC-6细胞有较好的保护作用,细胞周期结果显示细胞因子可明显阻滞细胞在G1期(P0.01),大黄素可明显促进细胞进入分裂期(P0.01),大黄素联合细胞因子组可促进细胞进入S期(P0.01),因此,大黄素促进细胞进入分裂期作用大于细胞因子阻滞细胞作用,大黄素联合细胞因子组有明显的促细胞生长作用。4.电镜下可见低氧6小时、24小时各组细胞均可见自噬小体出现;Real time-PCR检测与常氧对照组相比,低氧6小时、24小时后自噬相关基因Beclin-1及LC3表达量均上调(P0.01),其中自噬相关基因Beclin-1、LC3在低氧6小时的表达较24小时基因表达明显增多(P0.05),且大黄素联合细胞因子组较大黄素组、细胞因子组及对照组组表达增多(P0.05);Western-blot结果提示低氧6、24小时后,Beclin-1与LC3蛋白均有表达,大黄素联合细胞因子组较大黄素组、细胞因子组及对照组表达增多(P0.05)。5.Real time-PCR法及免疫荧光法检测HIF-1α及KGF两种外源基因在低氧0、6、24小时在IEC-6细胞内均稳定表达;Western-blot结果提示腺病毒携带的基因在转入细胞后HIF-1α蛋白稳定表达,在常氧对照组及低氧各组表达中无明显差异(P0.05)。结论:1.大黄素联合细胞因子在低氧条件下,可通过增强细胞的自噬机制对细胞起保护作用。2.大黄素联合细胞因子(HIF-1α和KGF)较单用大黄素或细胞因子促进自噬相关基因的激活及蛋白的表达作用更为明显。3.携带两种基因的腺病毒可稳定安全的将HIF-1α和KGF外源基因转染入细胞内部,并且在核酸水平及蛋白水平稳定表达。
【关键词】：自噬 大黄素 低氧诱导因子-1α 角质细胞生长因子 低氧 肠粘膜
【学位授予单位】：甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R57
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文缩略词表9-10
• 前言10-12
• 立题依据12-15
• 实验研究15-40
• 1. 材料15-17
• 1.1 主要仪器15
• 1.2 主要试剂与材料15-17
• 1.2.1 试剂与材料15-16
• 1.2.2 试剂配制方法16-17
• 2. 方法17-24
• 2.1 大黄素最佳浓度筛选17-18
• 2.2 腺病毒最佳感染MOI值筛选18
• 2.3 MTT法测细胞生存率18
• 2.4 流式细胞仪测细胞周期18-19
• 2.5 电镜下观察自噬体19
• 2.6 Real time-PCR测自噬相关基因Beclin-1、LC319-22
• 2.7 Western-blot测自噬相关蛋白Beclin-1、LC322-23
• 2.8 Real time-PCR测HIF-1α、KGF基因23
• 2.8.1 人HIF-1α、KGF基因设计如下：23
• 2.8.2 分别取常氧及低氧 6h、24h 的细胞因子组、大黄素联合细胞因子组提取的 RNA，，按照 2.6.3 方法进行实验23
• 2.9 免疫荧光法观察HIF-1α、KGF蛋白表达23-24
• 2.10 Western-blot测HIF-1α蛋白24
• 2.11 统计学方法分析24
• 3. 结果24-37
• 3.1 大黄素最佳作用浓度筛选24-25
• 3.2 腺病毒最佳感染MOI值筛选25-28
• 3.3 MTT法检测细胞存活率28-29
• 3.4 细胞周期29-31
• 3.5 电镜下观察自噬体31-32
• 3.6 自噬相关基因的检测32-34
• 3.7 自噬相关蛋白的检测34-35
• 3.8 Real time-PCR检测细胞转染双基因后HIF-1α及KGF在细胞中的基因表达3135-36
• 3.9 免疫荧光法检测细胞转染双基因后HIF-1α及KGF在细胞中的蛋白表达.323.10 Western-blot检测细胞转染双基因后HIF-1α在细胞中的蛋白表达36
• 3.10 Western-blot 检测细胞转染双基因后 HIF-1α在细胞中的蛋白表达36-37
• 4.分析与讨论37-40
• 结论40-41
• 参考文献41-46
• 综述46-54
• 参考文献51-54
• 攻读硕士学位期间的研究工作与成果54-55
• 致谢55-56
• 附录56-57

【参考文献】

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本文编号：345212