慢病毒介导中国人肠道产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究

发布时间：2021-11-12 06:38

　　目的:产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter fomigenes, Ox.F）是一种能降解草酸的肠道厌氧菌,其中降解草酸的关键酶是甲酰辅酶A转移酶（Formyl-CoA transferase, FCoAT）和草酰辅酶脱羧酶（Oxalyl-CoA Decarboxylase, OcoAD）。从中国人肠道产甲酸草酸杆菌Ox.F中克隆编码FCoAT的FRC基因和OCoAD的OXC基因,并将FRC基因和OXC基因分别与过表达慢病毒载体重组,制备能表达FCoAT和FCoAT的慢病毒,为下一步转染肝干细胞治疗高草酸尿症奠定基础。方法:用细菌基因组提取试剂盒提取中国人Ox.F的基因组DNA作为模板,用Taq高保真DNA聚合酶分别扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收扩增片段,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接,分别获得FRC基因和OXC基因的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并进行测序,筛选出携带完整目的基因的质粒pMD18T simple- FRC和pMD18T simple-OXC,质粒提取,用BamH I限制性... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：98 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

pMD18Tsimplevector示意图

图2 pLenti6.3/v5- DEST慢病毒载体示意图接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，质粒小量提取并测毒载体包装按照美国 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 转染手册进行：状态良好、处于对数生长期的 HEK293T 细胞，用 0.25％胰酶消化培养瓶，得到细胞悬液并计数后，按照每个 10cm 培养皿 6×106个细胞数接种于入完全培养液 DMEM +10% FBS 在 37℃，5%CO2的培养箱中培养过夜长状态稳定并达到细胞贴壁覆盖率达到 80％以上才行转染；二天转染前移去培养液，用无血清 DMEM 细胞培养基清洗培养皿底细胞l Invitrogen Opti-MEM 减血清细胞培养基； 9μg Packaging Mix（Invitrogen）和 3μg 慢病毒表达质粒加入经 37℃预热MEM 减血清细胞培养基中，轻轻混匀；

甲酸草酸杆菌的基因总 DNA 琼脂糖凝胶-Hind Ⅲ DNA Marker，2.基因组 DNA试剂盒（Agarose Gel）切胶回收 FRC 和取 1μl 进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图 41 2 3

【参考文献】：
期刊论文
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[5]离子色谱法测定尿草酸的研究[J]. 曾令启,陈志强,叶章群,杨为民.  中华实验外科杂志. 2003(10)
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本文编号：3490369