IL-17调控肝细胞参与肝脏损伤与修复

发布时间：2017-05-07 13:14

  本文关键词：IL-17调控肝细胞参与肝脏损伤与修复，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【背景】肝纤维化是肝脏受到各种急慢性刺激后引发的损伤修复反应。导致肝纤维化的主要病因有慢性病毒性肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪肝等。若损伤因素持续存在，导致细胞外基质不断聚集，肝纤维化逐步进展为肝硬化。一旦发展为肝硬化，其并发症多、预后差、死亡率高，严重危害人类健康。因此，肝硬化的发生机制受到越来越多的关注。大量研究显示细胞因子（如TGF-β1、TNF-、PDGF）、肝星状细胞、枯否细胞等均参与肝纤维化的发生发展，但是不能完全解释肝纤维化的发病机制。近年来有文献报道，白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17）可以促进肺纤维化。在多种肝脏疾病中，外周血IL-17升高并且与肝损伤的严重程度呈正相关，如酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、病毒性肝炎（尤其乙型病毒性肝炎）、非酒精性脂肪肝等。本课题组前期研究发现，四氯化碳（Carbon tetrachloride, CCl4）诱导小鼠肝纤维化以及自然恢复过程中，外周血IL-17水平呈动态变化且与肝纤维化程度密切相关；注射外源性的重组小鼠IL-17可以促进肝损伤；抗小鼠IL-17抗体可以减轻CCl4诱导的肝损伤。目前IL-17在肝脏内的表达水平尚不清楚。有研究证实IL-17可以直接激活肝星状细胞、促进枯否细胞分泌TGF-β1进而促进肝纤维化。占肝脏总体积80%的肝细胞是否受到IL-17的影响呢？有学者认为IL-17可以减轻IFN-γ诱导肝细胞的凋亡，也有学者认为IL-17对肝细胞不发挥作用。因此我们采用CCl4腹腔连续注射的方法诱导小鼠肝损伤模型以及CCl4干预原代培养的小鼠肝细胞模型，探讨小鼠肝损伤模型中肝脏内IL-17变化情况、肝细胞表面白细胞介素17受体（Interleukin-17recepter, IL-17R）的表达、IL-17对肝细胞的作用以及IL-17在肝细胞活化枯否细胞以及肝星状细胞的作用。进一步探讨IL-17在肝纤维化/肝硬化中的作用机制，有助于肝纤维化/肝硬化机制的阐明。 【目的】明确CCl4对小鼠肝内IL-17表达的影响；确定IL-17对肝细胞凋亡的影响及其机制；探索IL-17在肝细胞活化枯否细胞和肝星状细胞中的作用。 【方法】(1)腹腔注射CCl48周以诱导小鼠肝纤维化模型，8w后取小鼠肝脏、采集小鼠血清，前者用HE染色以及天狼星红染色方法检测小鼠肝脏损伤程度以及肝纤维化程度，后者用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALB、AST以及ALT的水平；在肝纤维化造模过程中取造模小鼠肝脏组织，用ELISA方法检测IL-17的表达水平；(2)分离小鼠肝细胞，用不同浓度的重组小鼠IL-17因子(Recombinant MouseIL-17, Rm IL-17)(5、10、15、20、25ng/ml)干预肝细胞，分别在干预24h、48h、72h后，用流式细胞术和TUNEL方法检测肝细胞凋亡；BrdU以及Ki-67方法检测肝细胞增殖；ELISA检测肝细胞分泌TGF-β1的水平。分离小鼠肝细胞，用6mM的CCl4预处理肝细胞1h用来建立体外肝细胞损伤模型，用上述不同浓度的Rm IL-17干预肝细胞，在不同时间点检测肝细胞凋亡、增殖以及分泌TGF-β1的水平，检测方法同上。用流式细胞术检测正常肝细胞以及体外损伤肝细胞表面IL-17R的表达量；Western blot方法检测Caspase-3以及Bcl-2的表达量；(3)用不同浓度的Rm IL-17干预正常肝细胞或CCl4体外损伤肝细胞，并分别与小鼠枯否细胞或肝星状细胞共培养，前者用ELISA以及Real-time PCR方法检测TGF-β1以及TNF-表达量；后者用Real-time PCR方法检测-SMA、TGF-β1、基质金属蛋白酶3（MMP3）、金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）和胶原层蛋白(Collagen-1)等肝纤维化相关因子的表达。 【结果】(1)腹腔注射CCl4第8w时，小鼠肝组织HE染色和天狼星红染色发现肝脏出现了显著的纤维化，血生化检测表明转氨酶增高、白蛋白降低，提示成功建立了小鼠肝纤维化模型。 (2) ELISA检测发现，在CCl4诱导建立小鼠肝纤维化的过程中，肝脏内IL-17水平显著升高，并具有时间依赖性。 (3)流式细胞术以及TUNEL染色表明：正常小鼠肝细胞在体外培养时，其自发性凋亡率为10%-15%。用CCl4处理原代培养的小鼠肝细胞，可诱导肝细胞凋亡。在体外培养和诱导肝细胞凋亡的过程中，加入Rm IL-17，发现IL-17可以显著抑制肝细胞的自发凋亡和CCl4诱导凋亡。 (4) BrdU以及Ki-67染色表明，IL-17对原代培养小鼠肝细胞的增殖无明显影响。 (5) ELISA结果显示，IL-17对原代培养小鼠肝细胞分泌TGF-β1无明显影响。 (6)流式细胞术检测发现，正常小鼠肝细胞表达一定水平的IL-17R，CCl4可显著提高IL-17R在肝细胞上的表达水平。 (7) Western blot表明，IL-17可以上调Bcl-2在肝细胞的表达，并抑制Caspase-3的活化。 (8)小鼠肝细胞与枯否细胞共培养可以诱导TGF-β1以及TNF-的表达，经IL-17预处理的肝细胞与枯否细胞共培养，TGF-β1和TNF-的表达量较对照组显著降低。 (9)小鼠肝细胞与肝星状细胞共培养时可以诱导-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表达，，经IL-17预处理的肝细胞与肝星状细胞共培养，-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表达量较对照组显著降低。 【结论】在CCl4诱导小鼠肝损伤的过程中，肝内IL-17和肝细胞IL-17R的表达水平均显著升高；IL-17可以通过上调Bcl-2，抑制Caspase-3活化而抑制自发性的和CCl4诱导的肝细胞凋亡；IL-17预处理可以降低肝细胞对枯否细胞以及肝星状细胞的活化效应；IL-17可能通过调控肝细胞凋亡参与肝脏损伤与修复。
【关键词】：IL-17 肝纤维化 肝硬化 CCl4 细胞凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-24
• 1. 肝纤维化/肝硬化在我国发病率高、预后差、死亡率高，目前尚缺乏有效治疗手段。因此，对其发病机制的研究至关重要14-15
• 2. 肝纤维化/肝硬化发病机制的研究现状15-16
• 3. 在肝纤维化/肝硬化中，肝细胞凋亡是最常发生的变化。肝细胞凋亡与炎症以及肝纤维化均密切相关16-18
• 4. IL-1718-24
• 第一部分 CCL4对小鼠肝内 IL-17 表达的影响24-31
• 1 材料和仪器24-25
• 2 方法25-28
• 3 结果28-30
• 4 讨论30-31
• 第二部分 IL-17 对肝细胞凋亡的影响及机制31-54
• 1 材料和仪器31-34
• 2 方法34-41
• 3 结果41-51
• 4 讨论51-54
• 第三部分 IL-17 在肝细胞活化枯否细胞、肝星状细胞中的作用54-68
• 1 材料和仪器54-57
• 2 方法57-61
• 3 结果61-66
• 4 讨论66-68
• 小结68-69
• 参考文献69-77
• 个人简历和研究成果77-78
• 致谢78

【共引文献】

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本文编号：349926