Toll样受体4通过依赖NFκ-B激活胱硫醚β合成酶介导肠易激综合征大鼠的内脏痛敏

发布时间：2017-05-10 12:08

  本文关键词：Toll样受体4通过依赖NFκ-B激活胱硫醚β合成酶介导肠易激综合征大鼠的内脏痛敏，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肠易激综合征(IBS)是一种以腹部不适伴排便习惯改变为特征的功能性肠病。近年来,随着人们生活节奏的加快、饮食结构的改变,神经、精神、感染因素所致的肠易激综合征发病率有上升趋势,对患者的生活质量和工作造成了很大的困扰。本实验目的是以新生期结肠炎大鼠(NCI)为动物模型,研究Toll样受体4与NF-?B调控内源性硫化氢合成酶胱硫醚β合成酶(CBS)表达的上调,以及在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛觉中的作用。方法1.以出生10天的雄性SD大鼠为对象,肛门处插入2cm,结肠内注射0.2ml的0.5%稀乙酸来建立内脏痛觉高敏的模型,注射等容量的生理盐水作为对照。待大鼠成年(6周)后,运用腹壁撤回评分(AWR score)方法评测NCI大鼠的痛行为反应。2.运用Western blotting方法分析对照组和实验组大鼠背根神经节(DRG,T13-L2)的Toll样受体4,NF-?B,CBS蛋白表达量。3.结肠管壁注射荧光素(Dil)来逆行标记结肠特异性背根节(DRG)神经元,运用全细胞膜片钳方法检测DRG神经元的兴奋性。4.运用免疫荧光的方法研究Toll样受体4是否与NF-?B、CBS在结肠相关DRG(T13-L2)神经元上共表达。5.运用染色质免疫共沉淀技术进一步验证在NCI大鼠的DRG中NF-?B与CBS的启动子区特异性结合情况。结果1.NCI增加肠相关DRG神经元(T13-L2)Toll样受体4的表达。2.行为学实验发现,鞘内注射Toll样受体4的拮抗剂CLI-095,能够显著降低NCI大鼠的内脏痛觉高敏。3.运用电生理膜片钳技术对肠特异性DRG神经元细胞进行研究后发现,Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能显著降低肠相关DRG神经元的兴奋性。4.为了进一步研究Toll样受体4的作用机制,我们采用免疫荧光的方法发现Toll样受体4与CBS在Dil标记的肠相关DRG神经元上共表达,并且Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能够翻转NCI大鼠结肠相关DRG的CBS的表达。5.免疫荧光结果发现,Toll样受体4与NF-κB在Dil标记的肠相关DRG神经元上也有共表达,另外,western blotting结果显示NCI能够增加细胞核NF-κB,并且Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能够翻转这一增加。6.腹腔注射NF-κB的拮抗剂PDTC,能够减少CBS的表达,并且可以降低NCI导致的内脏痛觉超敏。7.与对照组相比,染色质免疫共沉淀结果显示CBS与NF-κB的DNA结合位点在NCI大鼠肠相关DRG中的特异性结合显著增强。8.为了进一步确认Toll样受体4的作用机制,我们运用细胞培养的方法,体外孵育Toll样受体4的激动剂脂多糖(LPS),发现LPS可以显著增加NF-κB和CBS的表达,并且孵育NF-κB的拮抗剂PDTC可以翻转CBS的增加,但是孵育CBS的拮抗剂AOAA并不能翻转NF-κB的增加。结论我们的结果提示CBS的表达上调可能是由TLR4/NF-κB信号通路的激活来介导的,TLR4在IBS慢性内脏痛觉高敏的形成中发挥作用。因此,本实验研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制,从而可能为慢性内脏痛的治疗提供更有效的治疗靶点。
【关键词】：背根神经节 内脏痛 硫化氢 Toll样受体 NF-κB
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-13
• 第二章 材料与方法13-26
• 2.1 实验对象13
• 2.2 新生期结肠炎性刺激症（NEONATAL COLONIC INFLAMMATION ，NCI）模型的建立13
• 2.3 腹壁撤回反射(ABDOMINAL WITHDRAWAL REFLEX，AWR) 评分检测痛阈13-14
• 2.3.1 实验仪器13
• 2.3.2 实验方法13-14
• 2.3.3 给药方法14
• 2.3.4 实验用药14
• 2.4 WESTERN BLOTTING检测蛋白表达14-16
• 2.4.1 实验试剂14-15
• 2.4.2 实验仪器15
• 2.4.3 实验方法15-16
• 2.5 急性分离DRG神经元和全细胞膜片钳实验16-19
• 2.5.1 实验试剂16
• 2.5.2 实验仪器16-17
• 2.5.3 荧光染料DiI标记肠相关DRG神经元17
• 2.5.4 急性分离DRG神经元17-18
• 2.5.5 拉制玻璃微电极18
• 2.5.6 全细胞膜片钳记录18-19
• 2.5.7 神经元兴奋性记录19
• 2.6 原代DRG细胞培养19-21
• 2.6.1 实验试剂19-20
• 2.6.2 实验仪器20
• 2.6.3 急性分离DRG神经元20
• 2.6.4 培养DRG神经元20-21
• 2.7 免疫组化21-22
• 2.7.1 实验试剂21
• 2.7.2 实验仪器21
• 2.7.3 实验方法21-22
• 2.8 核蛋白提取22-23
• 2.8.1 实验试剂Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒（康为世纪）22-23
• 2.8.2 实验仪器23
• 2.8.3 实验方法23
• 2.9 染色质免疫共沉淀(CHIP)23-26
• 2.9.1 实验试剂Chromatin Immunoprecipitation Kit (Millipore公司)23
• 2.9.2 实验仪器23
• 2.9.3 实验方法23-26
• 第三章 实验结果26-37
• 3.1 TOLL样受体 4（TLR4）介导新生期结肠炎性刺激（NEONATAL COLONIC INFLAMMATION ，NCI）诱导的慢性内脏痛26-27
• 3.1.1 TLR4 的表达上调参与新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛26
• 3.1.2 TLR4 参与NCI诱导的慢性内脏痛觉超敏26-27
• 3.2 TLR4 抑制剂CLI-095 能够减少NCI大鼠肠相关DRG神经元的兴奋性27-29
• 3.3 TLR4 抑制剂CLI-095 能够减少NCI大鼠肠相关DRG神经元中CBS的表达29-30
• 3.4 NCI通过活化的TLR4 上调核转录因子NF-ΚB的表达30-32
• 3.4.1 TLR4 和核转录因子p65 在SD大鼠结肠特异性神经元中共表达30
• 3.4.2 NCI诱导NF-κB （p65）活化30-31
• 3.4.3 TLR4 的拮抗剂CLI-095 翻转NF-κB （p65）的高表达31-32
• 3.5 核转录因子NF-ΚB在NCI诱发的慢性内脏痛中的作用32-34
• 3.5.1 核转录因子p65 和胱硫醚合酶CBS在大鼠结肠特异性神经元中共表达32-33
• 3.5.2 NF-κB抑制剂PDTC翻转NCI诱导的成年大鼠内脏痛觉过敏33-34
• 3.6 NCI能够增强NF-ΚB和CBS基因启动子区的结合34-35
• 3.7 NF-ΚB抑制剂能够翻转TLR4 诱导的CBS蛋白表达的增加35-37
• 3.7.1 TLR4 激动剂LPS孵育DRG神经元可引起NF-κB和CBS蛋白表达的改变35
• 3.7.2 PDTC能够翻转LPS诱导激活的CBS的蛋白表达升高35-37
• 第四章 讨论37-40
• 参考文献40-45
• 综述45-56
• References50-56
• 攻读硕士学位期间公开发表的论文、会议摘要和奖励56-57
• 致谢57-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Emerging role of Toll-like receptors in the control of pain and itch[J];Neuroscience Bulletin;2012年02期

2 Cynthia KY Cheung;Justin CY Wu;;Genetic polymorphism in pathogenesis of irritable bowel syndrome[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

  本文关键词：Toll样受体4通过依赖NFκ-B激活胱硫醚β合成酶介导肠易激综合征大鼠的内脏痛敏，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：354715