MiR15a/16对HBV复制的调节作用及HBV所编码的蛋白质HBx反向调节microRNA表达的研究

发布时间：2021-12-25 03:45

　　众所周知,乙肝病毒是一种在人类中广泛存在的病原体。慢性乙肝病毒感染是造成肝癌发生的一个关键的因素,但是其分子机制还不是很清楚。microRNA介导病毒与宿主细胞之间的相互作用过程中发挥着重要的作用。宿主来源的microRNA对病毒的调控作用主要存在有两个方面：一方面,调控宿主细胞内的基因靶标或病毒的基因来协助病毒的复制。另一方面,诱导mRNA降解和抑制翻译等机制间接地调节宿主细胞和病毒自身的靶基因,参与宿主细胞对病毒侵染的抵御和病毒对宿主的抵抗与逃避。目前有关microRNA与HBV病毒相互调控作用的研究也越来越多。宿主microRNA对HBV复制的调控主要是通过直接或间接方式来调控。当HBV侵染宿主细胞之后,HBV可能会改变宿主细胞内miRNA的表达谱,但是其具体机制也不是很清楚。目前研究表明HBV侵染细胞之后,miRNA的表达谱会发生一些变化。据推测可能是HBV侵染之后激活宿主自身的一些特定转录因子（细胞因子）,而这些特定转录因子（细胞因子）则影响miRNA的转录或干扰rniRNA的成熟。本论文的主要研究发现有两个方面：一,发现miR15a直接靶定在HBV所编码的HBp和HBx基因... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：95 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 序言
    1. MicroRNA简介
        1.1 MicroRNA的定义和基本特征
        1.2 microRNA的发现
        1.3 microRNA的命名
        1.4 microRNA的生物合成
        1.5 microRNA的作用机制和生物学功能
            1.5.1 microRNA调控基因的作用机制
            1.5.2 miRNA的正向调控和可逆的抑制
            1.5.3 P-body,Stress Granules(SG),Multivesicular Bodies和Endosomes在miRNA介导基因表达沉默中的功能
            1.5.4 microRNA的生物学功能
    2. 乙肝病毒(HBV)简介
        2.1 肝病毒(HBV)的定义和基本特征
        2.2 乙肝病毒(HBV)所编码蛋白的生物学功能
            2.2.1 表面蛋白(S蛋白)的生物学功能
            2.2.2 核心蛋白(C蛋白)和e抗原(HBeAg)的生物学功能
            2.2.3 聚合酶P蛋白的生物学功能
            2.2.4 X蛋白的生物学功能
        2.3 HBV相关疾病以及相关治疗的近况和进展
    3. microRNA与病毒之间的网络调控作用
        3.1 microRNA对病毒的调控作用
        3.2 病毒自身编码的microRNA对其自身复制以及宿主的调控作用
            3.2.1 病毒自身编码的microRNA(vmiRNA)
            3.2.2 病毒编码的microRNA对病毒自身编码的基因表达,转录本RNA以及复制的调控作用
            3.2.3 病毒自身编码的microRNA对宿主mRNA的调控作用
        3.3 病毒对microRNA的调节作用
        3.4 miRNA在相关肝疾病中作用
        3.5 microRNA与HBV病毒的复制以及由其感染所引发的肝癌疾病中等相互调控作用的研究进展
            3.5.1 miRNA调控乙肝病毒HBV的复制
            3.5.2 miRNA与肝炎病毒导致的HCC
    4. miR15a/16的生物学功能
    5. 本课题的研究内容及意义
        5.1 本课题的研究内容
        5.2 本课题的研究意义
第二章 材料与方法
    1. 材料
        1.1 实验所用到的菌株,质粒和细胞系
        1.2 实验中所用到主要的生化试剂以及来源
        1.3 分子克隆相关实验中所用到的酶和试剂盒及来源
        1.4 分子克隆和生化实验等相关实验中所用到溶液及配置
            1.4.1 制备感受态细胞以及检测所用的溶液及配置
            1.4.2 SDS碱裂解法提取质粒所用的溶液及配置
            1.4.3 核酸电泳以及蛋白质电泳所用到的溶液及配置
        1.5 细胞实验中所用到的试剂来源以及所用的溶液的配置
            1.5.1 试剂
            1.5.2 细胞实验中所用到溶液的配置
        1.6 本实验中所用到的引物
        1.7 本实验所用到RNA oligo
        1.8 本实验中所构建的质粒
        1.9 本实验用到的仪器
        1.10 绘图软件
        1.11 分析软件
    2. 方法
        2.1 普通克隆的构建方法
        2.2 制备大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态细胞以及检测转化效率
            2.2.1 受体菌的活化培养
            2.2.2 感受态细胞的制备
            2.2.3 感受态细胞转化效率的检测
        2.3 SDS碱裂解法质粒DNA的制备(分子克隆所用)
        2.4 超纯质粒的制备(细胞转染所用)
        2.5 从DMEM培养液中提取HBV病毒颗粒(以24孔板为例)
        2.6 乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的检测(酶联免疫法)
        2.7 细胞实验操作
            2.7.1 细胞的复苏
            2.7.2 细胞传代培养
            2.7.3 细胞转染
            2.7.4 细胞冻存
        2.8 RT-PCR
            2.8.1 RNA的提取(以24孔的培养板为例)
            2.8.2 基因组DNA的消解
            2.8.3 RNA的逆转录
            2.8.4 用制备好的cDNA为模板进行PCR
        2.9 荧光定量PCR
            2.9.1 标准样品的制备
            2.9.2 样品及标准样品的扩增
        2.10 Western blot
            2.10.1 蛋白样品的制备一
            2.10.2 蛋白样品的制备二(从TRIzol中提取蛋白)
            2.10.3 蛋白含量的测定
            2.10.4 SDS-PAGE电泳
            2.10.5 转膜
            2.10.6 免疫反应
            2.10.7 化学发光,显影,定影
            2.10.8 凝胶图像定量分析
        2.11 双色荧光的检测
            2.11.1 细胞样品的处理
            2.11.2 荧光素酶活性的测定
第三章 结果与讨论
    1. 结果
        1.1 microRNA与HBV病毒之间存在重要的相互作用
            1.1.1 miRNApathway参与并影响HBV的复制
            1.1.2 HBV侵染宿主细胞之后,miRNA表达水平的变化
        1.2 miR15a/16抑制HBV增殖
            1.2.1 预测miR15a在HBV基因组上潜在的靶标信息
            1.2.2 miR-15a抑制HBV复制
        1.3 miR-15a分别靶定在HBx和HBp的CDS区域
            1.3.1 荧光素酶报告基因证实miR-15a对靶定在HBx和HBp的重叠区域的调控
            1.3.2 荧光索酶报告检测证实miR-15a对靶定在HBp区域的靶标位点的调控
            1.3.3 miR-15a对HBx蛋白的调节
        1.4 HBx可以调节miRNA的表达
    2. 讨论
第四章 研究工作总结与展望
参考文献
致谢



本文编号：3551730