肝细胞分泌高迁移率族蛋白HMGB1的过程观察及其提纯方法初步探讨

发布时间：2022-01-22 12:21

　　研究背景：重型肝炎是一种病死率很高的临床危重症。在我国,重型肝炎的主要原因仍是病毒性肝炎。研究证明,高迁移率族蛋白-1（HMGB1）在重型肝炎的发生发展中起着重要的作用。核蛋白HMGB1是生命所必须物质,近年来,胞外HMGB1的促炎症作用受到越来越多的学者关注。正常情况下,HMGB1动态结合于细胞核染色质上,因此,HMGB1如何从细胞核转移到细胞外是其发挥胞外作用的关键。目前已经取得共识的是“活化免疫细胞的主动分泌”和“坏死细胞的被动漏出”两种形式。而课题组前期研究发现,肝细胞作为实质细胞,在非坏死情况下亦能释放HMGB1,但其释放过程尚不明确。本研究第一部分以业已明确的免疫细胞分泌HMGB1的过程特点为对照,探讨肝细胞分泌HMGB1的条件,旨在回答上述问题。同时,肝细胞作为实质细胞,却证实同免疫细胞一样,能分泌炎症因子HMGB1,但其分泌的HMGB1有何生物学特性尚不明确。而探讨其生物学特性的前提是分离提纯出其分泌的HMGB1蛋白。目前对天然蛋白的纯化方法,尚处于探索阶段。本研究第二部分就分离提纯分泌型HMGB1的方法和条件进行了初步探索,为进一步研究其生物学特性奠定基础。目的：（1... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
目录
英汉缩略语名词对照表
前言
第一章 脂多糖诱导人肝细胞释放HMGB1的过程研究
    1.1 材料与方法
        1.1.1 细胞株
        1.1.2 试剂和材料
        1.1.3 主要仪器
        1.1.4 分组与干预
        1.1.5 细胞存活率测定
        1.1.6 细胞培养上清液LDH含量测定
        1.1.7 HE染色观察各组细胞形态
        1.1.8 DAPI染核观察各组细胞核形态
        1.1.9 荧光TUNEL检测细胞凋亡
        1.1.10 流式细胞技术检测细胞凋亡
        1.1.11 RT-PCR检测细胞HMGB1mRNA表达水平
        1.1.12 Western blot分析上清HMGB1蛋白含量
        1.1.13 细胞免疫荧光观察HMGB1蛋白移位
        1.1.14 统计学方法
    1.2 实验结果
        1.2.1 LPS刺激浓度的确定
        1.2.2 LPS作用不同时间点HepG2,L02及U937细胞存活率
        1.2.3 LPS作用不同时间点HepG2,L02及U937细胞上清LDH含量
        1.2.4 LPS刺激对HepG2,L02及U937细胞形态的影响
        1.2.5 LPS刺激对HepG2,L02及U937细胞凋亡的影响
        1.2.6 LPS作用对HepG2,L02及U937细胞HMGB1移位的影响
        1.2.7 LPS刺激对HepG2,L02及U937细胞分泌HMGB1蛋白的影响
        1.2.8 LPS刺激对HepG2,L02及U937细胞HMGB1mRNA表达水平的影响
    1.3 讨论
    1.4 结论
第二章 天然分泌型HMGB1蛋白的初步纯化
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试剂和材料
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 液体配制
        2.1.4 蛋白沉淀
        2.1.5 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
        2.1.6 二维凝胶电泳
        2.1.7 层析
        2.1.8 超滤浓缩
        2.1.9 银染
        2.1.10 Western blot验证各组分中的HMGB1蛋白
    2.2 结果
        2.2.1 二维凝胶电泳
        2.2.2 蛋白沉淀法所得蛋白初步层析图
        2.2.3 分子筛Sephadex G50/G75/G100层析峰
        2.2.4 离子交换层析图
        2.2.5 超滤浓缩的分离效果
        2.2.6 Western blot检测层析各组分HMGB1蛋白
        2.2.7 初步序贯分离结果
    2.3 讨论
    2.4 结论
总结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
攻读学位期间参与的项目及发表的文章


【参考文献】：
期刊论文
[1]TNF-α诱导人肝细胞系HepG2细胞释放HMGB1的研究[J]. 周蓉蓉,范学工,刘洪波,李宁,张磐,章保新,戴霞红.  中国免疫学杂志. 2009(02)
[2]脂多糖诱导肝细胞HepG2释放HMGB-1的研究[J]. 周蓉蓉,范学工,刘洪波,刘悦晖,贺新春,戴霞红.  生命科学研究. 2008(04)
[3]肝损伤模型小鼠高迁移率族蛋白-1的表达[J]. 刘洪波,范学工,刘悦晖,张磐,周蓉蓉,李宁,黄建军.  生命科学研究. 2008(02)
[4]HMGB1对淋巴细胞增殖、凋亡及Th1/Th2、Tc1/Tc2漂移的影响[J]. 王忠堂,姚咏明,盛志勇.  细胞与分子免疫学杂志. 2008(04)
[5]高迁移率族蛋白1对多形核白细胞黏附和游出肺毛细血管内皮细胞的影响及其机制[J]. 杨智勇,陶京,周峰,熊炯忻,吴河水,王春友.  世界华人消化杂志. 2007(22)
[6]蛋白质纯化的方法选择[J]. 杨道理,李保昌.  实用医药杂志. 2004(12)
[7]离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化[J]. 王雪,宋长征.  生物技术通讯. 2004(02)

博士论文
[1]中国明对虾在胁迫条件下肝胰脏的差异蛋白质组学研究[D]. 蒋昊.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2009



本文编号：3602191