HCN1在胃肠道分布特点及莱菔苷对其作用研究

发布时间：2017-05-18 02:08

  本文关键词：HCN1在胃肠道分布特点及莱菔苷对其作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 胃肠动力障碍疾病是临床常见疾病，困扰人类健康，不同程度上降低患者的生活质量，给病人、家庭及社会造成了巨大的心理及经济负担。胃肠动力障碍疾病一直被认为是由于胃肠道平滑肌的运动发生异常，尤其是起搏功能异常导致。近年来，cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal, ICC）成为胃肠起搏的研究热点，被认为在胃肠道起搏过程中起重要作用。有研究表明，在哺乳动物中超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（Hyperpolarization-activated cyclicNucleotide-gated channels, HCN）为具有慢波起搏特性的离子通道，其在心脏起搏以及神经电活动方面的作用已非常明确，该通道有4个亚型，各亚型间虽功能上存在一定差异，但均具有以下特点：超极化激活；钠、钾、钙离子混合通透；直接受环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）调控。目前研究证实，该通道不仅与神经系统疾病联系紧密，与胃肠道动力障碍疾病也存在一定联系。而对于HCN1亚型，本实验室前期预实验通过超微结构观察、免疫荧光双标、蛋白胚胎发育情况观察到HCN1在ICC上的特异分布，进一步离体实验通过给以HCN1特异性阻断剂ZD7288观察离体肌条的收缩变化，证明HCN1不但特异分布于ICC并可能是胃肠道起搏的始发离子通道，为探讨胃肠动力起搏的机制研究提出了新的理论。就目前临床上促胃肠动力药物的应用与开发方面来看依然是十分有限，尤其是无明显毒副作用的中药的开发尚需亟待解决。前期我们研究发现，白萝卜子即莱菔子具有显著促胃肠动力的功能，但其促胃肠功能的机制及可能靶点尚不明确。在此基础上，进一步研究莱菔粗提物的提纯物莱菔苷（Raphanusin）对胃肠道的作用机制对开发具有祖国医学传统特色的促胃肠动力新药有重要意义。 目的： 本研究拟利用免疫荧光双标记观察HCN1在大鼠胃肠各部分的分布特点以及胃肠道各部分的电生理特点，通过对大鼠灌胃进一步观察莱菔子提纯物莱菔苷对胃肠各部分电生理的影响，以及给予HCN1通道阻断剂ZD7288干扰后莱菔苷对胃肠电活动的影响情况。并进一步进行离体ICC原代培养，观察HCN1在离体ICC上的分布情况，并对离体ICC进行加药处理，对比莱菔苷与传统促胃肠动力药物胃复安对离体ICC的影响，从而探索莱菔苷对胃肠起搏通道HCN1的作用情况，为研究新的胃肠动力机制提供理论依据。 方法： 1．采用免疫荧光法，观察离子通道HCN1在胃肠道分布的特点，并采用电生理的方法，测定胃肠道不同部位胃肠运动的状况。 2．给予莱菔苷灌胃后，观察给药前后胃肠道不同部位的电活动的变化；再采用尾静脉注射HCN1特异性阻断剂ZD7288予以干预，观察予以同剂量莱菔苷灌胃后，胃肠道不同部位电活动给药前后变化情况，并以等量生理盐水灌胃作为对照进行观察。 3．采用酶消化法对新生大鼠胃肠道cajal间质细胞进行原代培养并鉴定。 4．将培养至2周的离体ICC进行加药处理，分别加入莱菔苷，胃复安，DMEM低糖培养液和生理盐水，比较莱菔苷与传统胃药胃复安对胃肠动力作用与影响。 结果： 1．HCN1在胃肠道的分布特点及电生理特点 采用免疫荧光双标记技术的方法，对大鼠胃肠进行HCN1与c-kit双重标记染色。结果显示：在胃、十二指肠、空肠及回肠部可见HCN1荧光标记，以胃底-体交界处分布最为密集，后依次为十二指肠、空肠、回肠。电生理结果显示：胃底-体交界处电活动频率比十二指肠处相比较慢，存在统计学差异（P0.05）；空肠与回肠处MMC的各项指标相比均无统计学差异（P0.05）。 2．莱菔苷对大鼠胃肠道动力的影响及其可能的作用靶点 采用灌胃的方法，给予大鼠1ml/kg浓度的莱菔苷观察到：胃、十二指肠处电活动波幅及频率与给药前相比明显增加，有统计学差异（P0.05）；空肠及回肠MMC与给药前相比周期明显缩短、活动期/周期、每分钟快波数明显增加，有统计学差异（P0.05）。再采用静脉注射给药方式给予HCN1特异性阻断剂ZD7288（0.5mmol/l）予以干预后再给予与前相同浓度的莱菔苷灌胃后观察到：胃、十二指肠处电活动波幅及频率与本组给药前、以及莱菔苷组给药后相比明显减弱，均有统计学差异（P0.05）；空肠及回肠MMC与本组给药前、莱菔苷组给药后相比周期明显延长、活动期/周期、每分钟快波数明显减少，均有统计学差异（P0.05）。生理盐水组，给药前后无统计学差异（P0.05）。 3．ICC的鉴定及HCN1的表达 采用酶消化法，对新生SD大鼠的十二指肠和空肠段进行原代培养，接种于置有事先用多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被的24孔培养板内，放入37℃，5%CO2培养箱内培养，隔天观察一次，并拍照，细胞培养至第7天进行免疫荧光双标检测，细胞呈c-kit抗体阳性。 4．莱菔苷对离体ICC的作用研究 对培养至2周时的离体ICC在24孔板里加药，激光共聚焦显微镜下观察并拍照，分成莱菔苷组、胃复安组，培养液组，生理盐水组四组，莱菔苷组与胃复安组分为1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml5个浓度梯度每孔500ul对照观察30min，培养液组与生理盐水组各给予等体积培养液、生理盐水对照。莱菔苷组中0.5mg/ml、0.2mg/ml两个浓度观察半小时可见细胞形态改变，细胞胞体紧缩，突起变细；胃复安组中1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml浓度中有类似改变，培养液组与生理盐水组无明显改变。 结论： 1．HCN1特异分布于胃肠道ICC细胞上，，且其分布密度呈现不均匀分布； 2．莱菔提取物—莱菔苷有明显的促胃肠道动力作用，且其作用的靶点可能是离子通道—HCN1； 3．莱菔苷通过ICC上的HCN1发挥促胃肠动力作用且其对ICC的形态改变作用传统胃动力药胃复安的作用效果相近。
【关键词】：HCN1 ICC 起搏机制 胃肠道 莱菔苷
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R57
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-29
• 第一部分 HCN1 在胃肠道的分布特点及胃肠电生理活动特征29-35
• 1 材料29-30
• 2 方法30-31
• 3 结果31-34
• 4 讨论34-35
• 第二部分 莱菔苷对胃肠道动力的作用及其靶点35-42
• 1 材料35-36
• 2 方法36
• 3 结果36-41
• 4 讨论41-42
• 第三部分 ICC 的体外培养鉴定及 HCN1 表达42-46
• 1 材料42
• 2 方法42-43
• 3 结果43-45
• 4 讨论45-46
• 第四部分 莱菔苷对离体 ICC 作用及其作用靶点46-52
• 1 材料46
• 2 方法46-47
• 3 结果47-50
• 4 讨论50-52
• 小结52-53
• 参考文献53-60
• 个人简历和研究成果60-61
• 致谢61

  本文关键词：HCN1在胃肠道分布特点及莱菔苷对其作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：374926