DNA甲基化在大鼠肝纤维化中的作用及其部分机制研究

发布时间：2017-05-22 18:32

  本文关键词：DNA甲基化在大鼠肝纤维化中的作用及其部分机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝纤维化是慢性肝脏疾病发生发展过程中的共有病理反应，活化的肝星状细胞分泌ECM增多是其发病的主要特征，因此肝星状细胞（HSC）活化被认为是肝纤维化发生的关键环节，抑制HSC活化是抗肝纤维化治疗关键步骤。研究发现DNA甲基化在HSC活化过程中具有重要作用。为了进一步探讨DNA甲基化在肝纤维化中的作用机制，通过在体与离体两个方面观察DNA甲基化相关蛋白在肝组织与细胞中的变化，及其对HSC活化的影响，并探讨其部分作用机制。研究内容主要包括以下四个部分： 1. PTEN在CCl4诱导的大鼠肝组织中的表达及甲基化的状态 CCl4皮下注射建立大鼠肝纤维化模型，正常组10只、模型组20只。自处理之日开始，模型组大鼠皮下注射50%CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次，共12周；正常组给予同样剂量花生油皮下注射，在12周末，取肝组织进行病理组织学和Masson胶原染色检测，并检测PTEN、α-SMA在大鼠肝组织中的表达变化。实验结果表明，在肝纤维化形成过程中PTEN表达降低。利用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）检测PTEN甲基化的状态，发现在CCl4诱导的大鼠肝组织中PTEN发生了高甲基化。 2. DNA甲基化抑制剂使PTEN发生去甲基化及恢复了PTEN的表达，从而抑制HSC的活化 以大鼠肝星状细胞株HSC-T6为研究对象，，利用TGF-β15ng/ml刺激30m后，加入不同浓度的5-AzadC温育48h，RT-PCR方法检测PTEN，α-SMA，Collagen I的mRNA表达变化；免疫印迹观察PTEN，α-SMA蛋白的表达。利用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）检测PTEN甲基化的状态。实验结果表明，在体外TGF-β1诱导HSC-T6中PTEN高甲基化，5-AzadC能使高甲基化的PTEN去甲基化进而恢复PTEN表达，并可抑制HSC-T6的活化。 3. DNMT1调控PTEN表达及其对甲基化的作用研究 根据DNMT1的碱基序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内，荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6的细胞增殖变化；RT-PCR检测DNMT1、α-SMA、Collagen I mRNA的表达；免疫组化，免疫荧光及Western Blot检测DNMT1、α-SMA蛋白的表达。结果发现，靶向沉默DNMT1可明显降低TGF-β1刺激的HSC-T6中α-SMA、Collagen I基因的表达水平；MSP-PCR检测显示，靶向封闭DNMT1基因的表达可使PTEN去甲化，进而抑制HSC-T6细胞的活化增殖。实验结果表明，DNMT1通过介导PTEN甲基化来促进HSC-T6活化。 4. DNA甲基化抑制剂和DNMT1沉默对PTEN下游信号通路的影响Western blot检测发现，CCl4诱导的肝组织和体外TGF-β1诱导的肝星状细胞活化中p-ERK，p-AKT的表达水平，DNA甲基化抑制剂和DNMT1沉默可抑制p-ERK，p-AKT表达水平。表明PTEN高甲基化激活了下游信号通路进而促进肝纤维化的形成。
【关键词】：肝纤维化 肝星状细胞 人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因 DNA甲基化 DNA甲基转移酶1
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2;R96
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 实验材料13-17
• 实验方法17-34
• 实验结果34-53
• 讨论53-56
• 结论56-57
• 参考文献57-63
• 附录63-65
• 致谢65-66
• 综述66-93
• References82-93

【共引文献】

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1 刘毅敏;张定林;肖湘;刘海红;赵先英;;熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展[J];重庆医学;2012年04期

2 刘琼;叶秀峰;张徽;;熊果酸抑制胶质瘤裸鼠移植瘤生长及其机制的初步探讨[J];第三军医大学学报;2009年11期

3 张有为;陈龙邦;;非小细胞肺癌DNA甲基化研究进展[J];中国肺癌杂志;2010年08期

4 周雄根;舒建昌;;微小RNA与肝纤维化关系的研究进展[J];广东医学;2011年24期

5 张新华;朱萱;;NOX通过ROS介导的信号通路与肝纤维化[J];国际消化病杂志;2011年01期

6 袁泉;柳满然;曾宗跃;周旭春;;microRNA与胃癌耐药的关系[J];国际检验医学杂志;2013年17期

7 孙衍昶;郭t$t$;赛克;王翦;王洁;陈芙蓉;张宗平;陈忠平;;MicroRNA-181b提高U87细胞对VM-26的敏感性研究[J];中国神经肿瘤杂志;2013年02期

8 Patrick-Denis St-Coeur;Mohamed Touaibia;Miroslava Cuperlovic-Culf;Pier Jr Morin;;Leveraging Metabolomics to Assess the Next Generation of Temozolomide-based Therapeutic Approaches for Glioblastomas[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2013年04期

9 汪章勋;周权;孟慧敏;张军;黄勃;;金龟子绿僵菌MicroRNA在蝉蜕和蚕血淋巴诱导下的差异表达分析[J];安徽科技学院学报;2013年05期

10 杨先涛;张祯祯;詹学;朱朝敏;;肺结核患儿外周血单个核细胞中microRNA表达的初步研究[J];第三军医大学学报;2013年19期

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1 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中国驼业进展[C];2013年

2 Yaogang Zhong;Tianran Ma;Xiuxuan Sun;Wentian Chen;Yuan Hu;Yannan Qin;Peixin Zhang;Haoxiang Wu;Jihong Cui;Huijie Bian;Zheng Li;;Alteration and location of GalNAc-binding proteins in activated human hepatic stellate cells[A];第十一届全国博士生学术年会（生物医药专题）论文集（中册，墙报P1-P24）[C];2013年

3 曾清华;周箐;康秀华;;血清microRNA的检测及在肺癌诊断中应用的进展[A];江西省第二次中西医结合呼吸疾病学术会议论文集[C];2012年

4 Yi Qu,MD;Guoying Mu;Yuwei Wu;Xin Dai;Fang Zhou;Xiaoyi Xu;Yan Wang;Fengcai Wei;;Overexpression of DNA Methyltransferases 1,3a,and 3b Significantly Correlates With Retinoblastoma Tumorigenesis[A];山东省医学会第十一次老年医学分会学术会论文汇编[C];2012年

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1 刘顺芳;癌基因DJ-1在人肝细胞癌中的作用及其机制研究[D];华中科技大学;2011年

2 安君艳;腺病毒介导的PTEN基因防治大鼠肝纤维化的体内外实验研究[D];河北医科大学;2011年

3 梁素丽;牛体细胞核移植重编程研究[D];西北农林科技大学;2011年

4 王娜;基于数据挖掘技术的肺癌早期预警模型研究[D];郑州大学;2012年

5 施寒清;细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能[D];东北师范大学;2010年

6 贾蓓;A型血友病人非整合诱导多能干细胞建系及其细胞疾病模型的建立[D];南方医科大学;2012年

7 刘森;三种蝙蝠表观遗传多样性及其影响因素研究[D];东北师范大学;2012年

8 高飞;青黄散治疗骨髓增生异常综合征去甲基化作用效应机制研究[D];北京中医药大学;2013年

9 李晓妮;miR-23a～24-2～27a簇促进乳腺癌细胞侵袭和转移机制的研究[D];中国科学技术大学;2013年

10 陈兆锋;胃癌相关miRNAs的筛选及其与胃癌发生发展的关系[D];兰州大学;2013年

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1 赵莹;四种抑癌基因p16、RASSF1A、CDH1、CDH13的甲基化状态及甲基转移酶活性和转录与肺癌的相关性研究[D];南京医科大学;2009年

2 王世美;TGF-β1及靶向Smad3基因shRNA慢病毒对大鼠肝细胞系BRL-3A增殖的作用[D];山西医科大学;2011年

3 尹东涛;SOX17在肺癌中的表观遗传改变及功能研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

4 郑力搏;PTEN在CCl_4诱导大鼠肝纤维化和自发逆转肝组织中的动态表达及其与在体肝星状细胞增殖、凋亡的关系[D];河北医科大学;2011年

5 郭剑;腺病毒介导的shRNA阻断PTEN表达对体外活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响[D];河北医科大学;2011年

6 张建;利莫那班对肝星状细胞增殖和凋亡的影响及作用机制[D];河北医科大学;2011年

7 赵旭东;非小细胞肺癌患者癌组织RAR-β基因甲基化的检测及其临床意义[D];安徽医科大学;2011年

8 张丽娜;丙戊酸钠提高顺铂对人卵巢癌HO-8910细胞株杀伤作用的机制研究[D];安徽医科大学;2011年

9 马志俊;三氧化二砷诱导雌激素受体表达的体内研究[D];郑州大学;2011年

10 张新华;熊果酸对大鼠肝星状细胞NOX亚基p47~(Phox)及其调控的下游信号通路的影响[D];南昌大学;2011年

  本文关键词：DNA甲基化在大鼠肝纤维化中的作用及其部分机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：386513