美洲大蠊提取物抗肝纤维化机理的体外研究

发布时间：2017-05-27 13:25

  本文关键词：美洲大蠊提取物抗肝纤维化机理的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：本研究以肝纤维化发生发展的重要细胞—肝星状细胞(HSC)为研究对象,研究美洲大蠊提取物对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增值、凋亡、细胞周期以及Ⅰ、Ⅲ型胶原、a-SMA表达的影响,并探讨其抗肝纤维化机制是否于MAPK(ERK1/2)信号通路有关,为美洲大蠊物提取物进一步治疗肝纤维化提供基础依据。 方法：1体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6)和大鼠正常肝细胞(BRL-3A),用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、16mg/mL)的美洲大蠊提取物对HSC-T6细胞和BRL-3A细胞作用24h时、48h时、72h时的增殖情况,找出美洲大蠊提取物对HSC-T6的最佳抑制浓度。 2应用流式细胞仪检测不同浓度(最佳抑制浓度及上下两个浓度)美洲大蠊提取物对HSC-T6细胞凋亡和周期的影响。用免疫荧光细胞化学染色法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、a-SMA的表达。 3将培养的大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)分为4个实验组：空白对照组；PDGF刺激组；PDGF+美洲大蠊提取物组；PDGF+ERK1/2阻滞剂组；培养24小时后提取蛋白,用western blot方法检测ERK1/2、P-ERK1/2表达水平。 结果：1MTT法检测结果显示：各浓度的美洲大蠊提取物干预HSC-T6细胞,实验组HSC-T6细胞的增殖率均低于对照组,差异具有统计学意义(P0.01),且随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐升高,呈明显的剂量和时间依赖性。美洲大蠊提取物作用于HSC-T6细胞24h、48h、72h时的IC50约为：6.086、3.497、2.410mg/mL。低浓度的美洲大蠊提取物对BRL-3A细胞无抑制作用,当浓度4mg/mL时对BRL-3A细胞具有抑制作用,与对照组相比,差异具有统计学意义(P值均0.01),随着药物浓度的增加,对BRL-3A细胞的增殖抑制率加大,也呈现明显的时间与剂量依赖性。当美洲大蠊提取物浓度为4mg/mL时,对BRL-3A细胞的抑制作用增加,4mg/mL为美洲大蠊提取物的最佳抑制浓度。 2流式结果显示：不同浓度(2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)的美洲大蠊提取物干预HSC-T6细胞24小时,可促进HSC-T6细胞的凋亡,凋亡率呈剂量依赖性,当浓度4mg/mL与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。流式细胞周期结果显示：随着药物浓度的增加,G0/G1期细胞数所占比例逐渐增多(P0.05),S期细胞呈现下降的趋势,而对G2/M期细胞无影响。 3免疫荧光细胞化学染色法显示：正常HSC-T6细胞a-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原呈强阳性表达,用浓度为4mg/mL的美洲大蠊提取物干预24小时后,α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原的荧光量减少,表达减弱。 4Western blotting结果显示：PDGF作用24小时后,HSC-T6细胞p-ERK1/2表达增加,用美洲大蠊提取物及ERK通路阻滞剂PD98059干预后ERK1/2的磷酸化水平明显降低。 结论：1美洲大蠊提取物在体外可抑制HSC-T6细胞的增殖,其抑制作用具有一定时间和剂量依赖性,美洲大蠊提取物对HSC-T6的最佳抑制浓度为4mg/mL。 2美洲大蠊提取物可诱导HSC-T6细胞的凋亡,并能干扰细胞周期,使细胞生长阻滞于G0/G1期。 3美洲大蠊提取物能抑制a-SMA的表达,并能抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。 4美洲大蠊提取物能够抑制PDGF刺激的大鼠HSC的增殖,其抗肝纤维化机制与MAPK(ERK1/2)信号通路有关。
【关键词】：美洲大蠊提取物 肝星状细胞 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期 血小板衍生 生长因子 细胞外信号调节激酶 1/2
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 英文~.略词5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分：美洲大蠊提取物对大鼠肝星状细胞最佳抑制浓度的研究14-27
• 材料与方法14-18
• 结果18-25
• 讨论25-27
• 第二部分：美洲大蠊提取物对大鼠肝星状细胞细胞周期、凋亡以及对Ⅰ/Ⅲ胶原、α-SMA表达的影响27-39
• 材料与方法27-30
• 结果30-36
• 讨论36-39
• 第三部分：美洲大蠊提取物对PDGF-BB刺激的大鼠肝星状细胞增殖及ERK1/2磷酸化水平的影响39-52
• 材料与方法39-46
• 结果46-49
• 讨论49-52
• 全文结论52-53
• 参考文献53-57
• 综述57-70
• 参考文献66-70
• 攻读期间发表论文70-71
• 致谢71

【参考文献】

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本文编号：400112