EGCG和PC-B2对AFB_1致肝细胞DNA损伤的保护作用与机制研究

发布时间：2017-06-13 01:07

  本文关键词：EGCG和PC-B2对AFB_1致肝细胞DNA损伤的保护作用与机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最常见、毒性最大、致癌性最强,主要损害肝脏并易诱发肝癌,属于Ⅰ类强致癌物。在抵抗AFB1毒作用的药物研究中,植物多酚类化学物(Polyphenols Phytochemicals)愈来愈受到人们的关注。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin Gallate, EGCG)作为绿茶主要活性成分,具有抗氧化、抗突变、诱导癌细胞凋亡、提高机体免疫力的效果,是儿茶素类化合物中生物学效应最强的一种。原花青素B2(PC-B2)是植物界中一类广泛存在的天然多酚类化合物,属于强抗氧化剂,可以有效清除人与动物体内多余的自由基,保护细胞及组织免受氧化损伤。PC-B2药理作用广泛,具有保护心血管、预防高血压、抗辐射、抗突变、抗肿瘤等作用。本研究拟通过体外细胞培养实验平台,探讨E GCG与PC-B2对AFB1染毒后的人胚肝细胞DNA损伤的保护作用,具体研究过程如下：第一部分AFB1对L-02细胞生存率、凋亡率及DNA损伤的影响目的探讨不同浓度AFB1对体外培养人胚肝细胞(L-02细胞)生存率、凋亡率及DNA损伤的影响。方法体外培养L-02细胞,采用AFB1进行干预,AFB1用药浓度分别为：0、5、10、20、40、80mg/L AFB1。倒置显微镜观察各组细胞形态学的变化,用MTT法测定细胞的存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用单细胞凝胶电泳试验(SCGE)观察细胞DNA损伤情况。结果与对照组比较,10mg/L及以上浓度AFB1干预48h后细胞形态发生变化,低浓度下表现为细胞皱缩、体积变小,高浓度下细胞皱缩变为圆形,出现大量漂浮细胞及细胞碎片,形态学变化的程度与AFB1浓度有关。10mg/L及以上浓度AFB1作用48h后存活率均明显低于对照组(P0.05)；5mg/L及以上浓度AFB1作用48h后凋亡率均明显高于对照组(P0.05)；且10mg/L及以上浓度AFB1干预存在剂量-效应关系,随着AFB1作用浓度的增加,L-02细胞存活率减少(P0.05),凋亡率增加(P0.05)。SCGE实验结果显示：与对照组比较,AFB1作用L-02细胞48h后,10mg/L及以上浓度组细胞彗星尾部DNA百分率、Olive尾距增高,差异有统计学意义(P0.05),并且呈剂量-效应关系,随着AFB1浓度的增加,L-02细胞的DNA损伤增大。结论10mg/L及以上浓度AFB1有细胞毒性、抑制细胞生长以及损伤细胞的DNA的作用；5mg/L及以上浓度AFB1能提高细胞凋亡率；随着AFB1浓度的升高,呈现剂量-效应关系；40mg/L浓度AFB1能有效抑制细胞生长、造成较严重的细胞DNA损伤,但不至于立刻导致细胞死亡,因而40mg/L浓度被选为后续试验的参考浓度。第二部分EGCG与PC-B2对AFB1致L-02细胞生存率、凋亡率、DNA损伤以及Bc1-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表达的影响目的探讨EGCG与PC-B2对AFB1致体外培养人胚肝细胞(L-02细胞)生存率、凋亡率、DNA损伤以及、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表达的影响。方法体外培养L-02细胞,实验设立6组：(1)空白对照组：L-02细胞仅给予培养液；(2)溶剂对照组给予加2%DMSO溶剂的培养液；(3)AFB1染毒组：L-02细胞经40mg/L的AFB1单独作用；(4) EGCG组：L-02细胞在AFB1染毒同时给予50mg/L的EGCG作用；(5)PC-B2组：L-02细胞在AFB1染毒同时给予200 mg/L的PC-B2;(6)EGCG与PC-B2组：L-02细胞在AFB1染毒同时给予5Om g/L的EGCG与200 mg/L的PC-B2。以上各组2天换液一次,3-5天传代一次,一周后,观察各组细胞形态学的变化,用MTT法测定细胞的存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用单细胞凝胶电泳试验(SCGE)观察细胞DNA损伤情况,采用Western blot法分析Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53 5个基因的表达。结果(1)与对照组比较,AFB1染毒组能显著抑制L-02细胞生长,EGCG与PC-B2均能降低AFB1对细胞的生长抑制作用,使生长抑制率从61.12%降至42.18%和46.72%; EGCG与PC-B2联用则使AFB1对肝细胞的生长抑制率从61.12%降至37.15%。SCGE实验结果表明EGCG与PC-B2单用／联用均能减小AFB1引起的L-02细胞DNA损伤(P0.05),其彗星Olive尾矩值分别为AFB1染毒组9.72±2.64,EGCG组5.91+1.79,PC-B2组5.36+1.17；EGCG+PC-B2组4.47+1.27。实验各组L-02细胞经处理后,早期凋亡率(%)分别为空白对照组2.63±0.28,溶剂对照组3.01+0.45,AFB1染毒组13.63+3.79,EGCG组8.26±1.67,PC-B2组7.89+1.52,EGCG+PC-B2组4.68±0.51,实验结果呈显著性差异(P0.05)；与溶剂对照组相比,AFB1染毒组能上调caspase-3、 caspase-9的表达(P0.05),下调bcl-2/ Bax(P0.05)；而EGCG组与PC-B2组中表明,EGCG与PC-B2单用均能下调caspase-3、caspase-9的表达(P0.05),显著上调bcl-2/Bax(P0.05),而EGCG与PC-B2两者联用时,对caspase-3、caspase-9、bcl-2/Bax的影响更为显著(P0.05)；无论是EGCG与PC-B2单用还是联用,对P53的表达水平影响不明显。结论AFB1能显著抑制L-02肝细胞的生长,并使细胞的DNA损伤程度加重；EGCG与PC-B2单用或联用可提高细胞的生存率,降低细胞凋亡率与DNA损伤程度；EGCG与PC-B2对AFB1长时间暴露的L-02细胞caspase-3、caspase-9基因的表达显著下调,bcl-2/B ax比值显著升高,EGCG与PC-B2能降低AFB1致L-02细胞DNA损伤与细胞凋亡率,其作用机制可能与下调caspase-3、 caspase-9的表达,升高bcl-2/Bax比值有关。
【关键词】：EGCG PC-B2 AFB_1 L-02细胞 肝细胞损伤 基因表达
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 个人简历3-5
• 缩写词汇中英文对照表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-16
• 第一部分 AFB_1对L-02细胞生存率、凋亡率及DNA损伤的影响16-35
• 1 材料与方法17-22
• 2 结果22-28
• 3 讨论28-29
• 参考文献29-35
• 第二部分 EGCG与PC-B2对AFB1致L-02细胞生存率、凋亡率、DNA损伤以及Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表达的影响35-54
• 1 材料与方法36-45
• 2 结果45-52
• 3 讨论52-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-59
• 综述59-72
• 参考文献64-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 卿春华;陈平;向旭东;;茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响[J];中南大学学报(医学版);2010年02期

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3 郭银燕;赵伟;文剑;;应用基因芯片技术研究肝癌组织特异性候选基因[J];江苏医药;2009年06期

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本文编号：445359