叶酸缺乏与基因甲基化在溃疡性结肠炎发病机制中的作用研究
发布时间：2017-06-13 00:07
本文关键词：叶酸缺乏与基因甲基化在溃疡性结肠炎发病机制中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的： 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种特发性肠道慢性炎症性疾病,其发病机制目前尚未完全明确。现认为是遗传、感染、环境和免疫因素等多种因素相互作用的结果。有研究发现促炎因子干扰素γ在UC发病中发挥关键作用,在UC结肠黏膜中其表达水平明显增多,而且干扰素基因启动子区存在低甲基化改变,其高表达很可能是基因低甲基化的结果。另外有研究表明,在UC小鼠模型中,给予甲基供体(叶酸、维生素B12)缺乏食物可促使某些细胞炎症因子及化学因子的表达增多,进一步加重结肠黏膜炎症程度。本研究通过给予UC小鼠模型叶酸缺乏食物,并检测血清叶酸,结肠黏膜干扰素Y的表达水平及干扰素基因甲基化水平,分析叶酸缺乏是否通过导致基因低甲基化,使干扰素γ高表达而在UC发病机制中发挥作用,为UC的诊断及治疗提供新的依据。 材料和方法： 1动物模型的建立及分组：选取符合实验要求的雌性BALB/C小鼠24只,并随机分为4组,每组6只,分组如下：A组叶酸缺乏(D),造模(DSS+)；B组标准饮食(C),造模(DSS+)；C组标准饮食(C),未造模(DSS-)；D组叶酸缺乏(D),未造模(DSS-)。D：予以无叶酸饮食饲养；C：给予等量标准饮食,饮水量不限；DSS+：自第6周起,给予5%葡聚糖硫酸钠溶液作为饮用水,持续7天,拟建立急性结肠炎小鼠模型：DSS-：仅饮用纯净水,作为对照。 2一般状况观察：分别于实验开始前,第5、6周末记录小鼠体重变化；每日观察小鼠饮食、饮水量,活动状态等生命体征情况；自第6周起至实验结束,每日观察并记录小鼠粪便性状、肛周红肿、糜烂及便血程度。实验结束后,分别采集4组小鼠尾静脉血及新鲜结肠黏膜组织标本。 3结肠炎症活动度评价：根据小鼠体重减轻程度、粪便性状、便血程度计分,“正常”计为0分,其余根据程度不同分别计为1、2、3、4分,记录总分数,依据“结肠炎症活动指数”=总分数/3(0-4),评估结肠炎症活动度；0为健康,4表示炎症活动程度最大。 4血清叶酸检测：采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠外周静脉血清叶酸水平。 5干扰素γ的表达：利用免疫组织化学染色法检测小鼠结肠黏膜组织干扰素γ的表达。 6干扰素基因甲基化：应用生物信息学技术进行干扰素基因启动子区CpG岛预测并设计甲基化特异性PCR引物。提取结肠组织DNA,应用MSP检测干扰素基因启动子区CpG岛甲基化水平。 结果： 1外周静脉血清叶酸水平 分别检测四组小鼠血清叶酸浓度,单位为ng/ml, A组浓度值范围在2.5～3.0,平均值为2.75；B组范围在13.2-14.1,平均值为13.6；C组范围在12.5～14.5,平均值为13.5,；D组范围在2.4～3.1,平均值为2.8。A组和D组的血清叶酸水平较B组和C组明显降低,差异有统计学意义(P0.05)；B组与C组之间,A组与D组之间相比较,差异无统计学意义(P0.05),P值分别为0.62和0.25。 2结肠黏膜组织干扰素γ表达水平 A组和B组结肠黏膜组织干扰素γ表达水平较C组和D组均明显增多,差异有统计学意义(P0.05)；A组较B组明显增多,差异有统计学意义(P0.05)；C组与D组之间相比较,差异无统计学意义(P0.05)。3干扰素γ表达水平与结肠炎症活动性指数的相关性分析 A组和B组中,干扰素γ表达水平与结肠炎症活动性指数呈正相关,相关系数r为0.796(P0.01)。 4叶酸水平分别与干扰素γ表达水平、结肠炎症活动性指数的相关性分析 A组中,叶酸水平分别与干扰素γ表达水平、结肠炎症活动性指数呈负相关,相关系数r分别为-0.880、-0.997(P0.05)；B组中,叶酸水平与干扰素γ的表达、结肠炎症活动性指数不具有相关性(P0.05)；C组中,叶酸水平与干扰素γ表达水平无相关性(P0.05)；D组中,叶酸水平与干扰素γ水平呈负相关,相关系数r为-0.867(P0.05)。 5各组小鼠结肠黏膜组织干扰素基因MSP检测,未出现基因启动子区CpG岛甲基化 MSP产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测IFNG的甲基化改变,A、B、C、D四组样本分别用甲基化特异性引物扩增,其产物经检测未出现甲基化条带；四组样本用非甲基化特异性引物扩增,其产物经检测出现非甲基化条带,基因扩增产物的大小约70bp(50bp-100bp)；空白对照未出现扩增条带。 结论： 1在急性溃疡性结肠炎小鼠模型中,叶酸的缺乏可导致炎症因子干扰素Y的表达增高,加重结肠黏膜炎症活动性的程度。 2在急性溃疡性结肠炎小鼠模型中,干扰素基因启动子区CpG岛低甲基化或许不是导致结肠黏膜干扰素γ表达增多的直接因素。 3叶酸的缺乏导致干扰素基因启动子区CpG岛低甲基化,进而引起干扰素γ高表达,在急性溃疡性结肠炎小鼠模型中的作用不明显。
【关键词】：溃疡性结肠炎 叶酸缺乏 干扰素γ 干扰素基因 甲基化特异性PCR CpG岛 酶联免疫吸附 免疫组织化学
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574.62
【目录】：
- 中文摘要4-7
- Abstract7-11
- 缩略语/符号说明11-12
- 前言12-14
- 研究现状、成果12-13
- 研究目的、方法13-14
- 一、叶酸缺乏在溃疡性结肠炎发病机制中的研究14-28
- 1.1 对象和方法14-20
- 1.1.1 主要仪器14-15
- 1.1.2 主要试剂15
- 1.1.3 动物模型的建立15-17
- 1.1.4 标本的采集17-18
- 1.1.5 实验方法18-20
- 1.1.6 统计学分析20
- 1.2 结果20-25
- 1.2.1 小鼠血清叶酸测定20-22
- 1.2.2 小鼠血清叶酸测定22
- 1.2.3 小鼠结肠黏膜组织干扰素γ免疫组化检测结果22-24
- 1.2.4 不同组间IFN-γ的表达与炎症活动性指数的相关性分析24
- 1.2.5 不同组间血清叶酸水平与IFN-γ表达、黏膜炎症活动性指数的相关性分析24-25
- 1.3 讨论25-28
- 二、溃疡性结肠炎中干扰素基因甲基化水平的研究28-41
- 2.1 对象和方法28-36
- 2.1.1 主要仪器29
- 2.1.2 主要试剂29-30
- 2.1.3 实验方法30-35
- 2.1.4 统计学分析35-36
- 2.2 结果36-37
- 2.2.1 组织中DNA质量的检测36
- 2.2.2 组织中干扰素基因甲基化的检测36-37
- 2.3 讨论37-41
- 结论41-42
- 参考文献42-46
- 发表论文和参加科研情况说明46-47
- 综述 溃疡性结肠炎的发病机制和最新治疗进展47-60
- 综述参考文献55-60
- 致谢60
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 朱芳丽;李秀荣;张晓岚;;重度溃疡性结肠炎的治疗进展[J];临床药物治疗杂志;2010年01期
2 陈洁玲;肖伟;林彬;g采，
本文编号：445254
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/445254.html
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