醛固酮经非基因组途径激活氧化应激通路调控大鼠肝星状细胞收缩迁移的机制研究

发布时间：2017-06-29 07:29

  本文关键词：醛固酮经非基因组途径激活氧化应激通路调控大鼠肝星状细胞收缩迁移的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 慢性肝病是威胁人类健康并耗费大量卫生资源的“全球公共健康问题”。我国是肝病大国,病毒性肝炎的发病和流行情况十分严重。随着人民生活水平的日益提高,由脂肪性肝病所导致的肝纤维化以及进一步发展而形成的肝硬化,同样对国民经济发展和人民健康造成严重威胁。因此,积极探索肝纤维化发生、发展的相关机制,不仅是预防和治疗肝纤维化的重要课题,对保护我国有限的医疗资源、维持社会经坊良好发展也具有重要意义。 肝纤维化是由各种致病因子所引起的肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质(fibrillar extracellular matrix, ECM)过度沉积的病理过程,是多种肝脏慢性疾病向肝硬化、门脉高压甚至肝癌等进一步发展恶化的重要中间环节。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化被认为是肝纤维化发生发展的中心环节,多种致纤维化因素均以HSC作为最终靶细胞,通过活化静止状态下的HSC而诱导肝纤维化发生并促进其发展。活化后的HSC大量增殖并迁移至肝窦血管入口处,收缩加强,致使肝窦直径缩小、阻力增大,一方面通过挤压肝窦以增加肝内血管阻力,另一方面造成肝组织瘢痕挛缩而进一步增加肝内血管阻力。目前,肝内血管阻力增加被认为是引起门脉高压的重要因素,肝内微循环障碍是导致门脉高压的重要因素之一。有研究指出,门脉高压治疗的关键在于控制肝窦内皮功能失调和抑制血管生成。因此,抑制HSC的过度活化及降低门静脉压力就成为防治肝纤维化发生发展的关键。 研究证实,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)同样存在于局部组织,如肝脏中,且与器官纤维化的发生密切相关。在肝内,RAAS可能参与门脉高压的调控。研究表明醛固酮(Aldo)具有促进HSC收缩的作用,但醛固酮对HSC收缩与迁移的调控机制,以及醛固酮受体拮抗剂螺内酯是否能够通过抑制HSC收缩来降低肝内阻力、缓解门脉高压,目前鲜有文献报道。因此,本课题致力于研究Aldo对HSC收缩与迁移的调控机制,并探索醛固酮受体拮抗剂螺内酯在缓解肝纤维化及治疗门脉高压时的作用机理。 HSC的收缩可由钙依赖途径和非钙依赖途径两种方式产生,近年研究认为,非钙依赖途径在HSC的收缩过程中起主要作用。而在非钙依赖途径中,RhoA-ROCK通路对HSC收缩的调控则可能起着主导作用。Rho族蛋白通过调节肌动蛋白和细胞骨架重组而调节细胞的收缩和迁移,同时,激活的RhoA和ROCK既可通过抑制内皮来源的N0生成而促进细胞和血管收缩,又可通过降低eNOS表达直接促进细胞收缩和缩血管效应,从而诱导门脉高压的形成。 近年来,Aldo的非基因组调控受到研究人员重视。与基因组调控方式不同,在非基因组调控方式中,激活的盐皮质激素受体(MR)不发生核转位,因而不参与靶基因转录的调控。非基因组效应具有快捷、高效的特点,对于研究细胞收缩、迁移、内皮功能紊乱、血管生成等功能的变化有重要意义。在众多非基因组调控方式中,小窝蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)介导的非基因组效应是最为重要的一类。 小窝是由外胞浆膜内陷而形成的细颈瓶状结构,其内富含胆固醇和神经鞘脂,可作为锚定信号分子的暂时性平台,与胞膜运输、信号转导、钙通道、脂质再循环等众多细胞事件有关。Caveolin蛋白是构成小窝的主要结构蛋白,以Cav-1分布最为广泛、功能最为全面,研究也最为深入。Cav-1蛋白可作为信号分子的支架,将MR、Src、PDGFR、Rho GTPase等信号分子区室化于小窝之中,这些分子及相关下游通路物质可转位至小窝内,通过相互对话(crosstalk)以产生快速调控效应。在小窝介导的信号通路中,Src激酶是Cav-1非基因组调节通路的关键中介,它可进一步调控下游通路中的PI3K/Akt、NADPH氧化酶、Rho-GTPase等。值得注意的是,Src可促进Cav-1的Tyr14位点磷酸化,一方面引起因与cav-1结合而被抑制的eNOS释放,促进NO的生成；另一方面激活Rho-GTPase而促进细胞收缩和迁移。由于MR等多种相关受体被激活后可向小窝内转位,因此Aldo的非基因组作用如迁移、炎症反应、NO合成、血管生成、氧化应激多与小窝有关。 近年来,氧化应激反应在器官纤维化病变中的作用机制受到越来越多的研究人员的关注。氧化应激是机体或细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度产生、内源性抗氧化防御功能减弱所致的氧化/抗氧化平衡失调而引起的组织或细胞损伤过程。ROS主要产生于线粒体及微粒体氧化还原反应的电子传递过程中,此外,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶、NO合酶以及环氧合酶等催化的反应过程中,均可伴ROS生成。大量文献证实,氧化应激反应在器官纤维化的发生、发展过程中扮演关键角色,各种引起肝纤维化病变的致病因素几乎均利用氧化应激通路参与肝纤维化病变的调控。肝内过量ROS不仅可直接诱导HSC活化、增殖,促进HSC迁移、收缩并合成和分泌大量胞外基质,尚可刺激肝细胞、库否细胞等生成大量炎症介质及细胞因子,如血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、转化生长因子-β(Transforming growth factor beta, TGF-p)等,间接诱导HSC的活化与增殖。由此可见,氧化应激反应对于肝纤维化的发生发展亦起到关键作用。 醛固酮在肾小球系膜细胞、输尿管上皮细胞等多种细胞中具有诱导ROS生成的作用已见诸报道,局部RAAS在诱导组织器官氧化应激水平升高,进而促进组织、器官的纤维化改变等方面亦有研究证实。如前所述,在肝脏纤维化病变过程中,局部RAAS同样表现活跃,HSC自身醛固酮的合成与分泌均有明显升高,因此,探索醛固酮诱导大鼠HSC收缩迁移的机制以及其在肝纤维化形成过程中对胞内氧化应激途径的调控机制就成为本课题的研究重点。由于小窝可区室化盐皮质激素受体(MR)以及NADPH氧化酶等,我们推测小窝与醛固酮刺激后HSC内信号转导和细胞内氧化应激反应等活动均密切相关,醛固酮可能通过小窝所介导的非基因组依赖的调控方式诱导HSC中ROS的过量生成,进而通过RhoA/Rock通路实现HSC的活化并诱导HSC发生增殖、收缩、迁移等一系列细胞特性和生理功能的改变。 研究目的 本课题拟研究醛固酮经小窝所介导的非基因组通路,调控HSC内氧化应激水平,激活RhoA/Rock等相关信号通路的机制,深入探讨醛固酮经cav-1相关的非基因组通路调控HSC活化、收缩、迁移的机制,为阐明醛固酮在门脉高压形成过程中的调控机制提供新线索,为探寻门脉高压及肝纤维化的防治靶点提供新的思路。 研究方法 1、分离培养原代大鼠肝星状细胞：原位灌注结合离体灌注、密度梯度离心结合差速贴壁法分离并培养原代大鼠肝星状细胞,以肝星状细胞标记蛋白a-SMA免疫荧光染色鉴定细胞纯度,选择体外培养第2-5代大鼠肝星状细胞进行相关体外细胞试验。 2、小窝蛋白提取实验：以10cm细胞培养皿培养原代大鼠肝星状细胞,待培养皿内细胞融合度达80%时,进行12小时饥饿处理,并给予相关药物干预,处理完成后裂解细胞并匀浆,蔗糖密度梯度离心分离蛋白并以冷丙酮沉淀纯化,蛋白免疫印迹实验检测目的蛋白含量变化。 3、胆固醇耗竭与重装填实验：向贴壁生长且状态良好的原代大鼠肝星状细胞培养皿中加入终浓度为5nM的MCD溶液,于37℃恒温细胞培养箱孵育30min后,以温PBS缓冲液轻轻冲洗细胞,即可去除细胞内胆固醇；以5m1浓度为50nM的MCD溶液溶解lmg胆固醇,取该溶液加入胆固醇耗竭处理后的细胞培养基内,使MCD终浓度为5nM,细胞置于37℃恒温细胞培养箱孵育30min,即完成胆固醇重装过程。 4、Transwell细胞迁移实验：将制备好的原代大鼠肝星状细胞悬液计数后加入Transwell上室内,于上、下室中分别加入无血清培基和含20%胎牛血清的完全培养基,施加相应药物干预后将细胞置于孵箱内培养适当时间,孵育完成后,弃培基,以PBS清洗细胞并以甲醇固定细胞,随后进行结晶紫染色并于显微镜下计数迁移细胞数目。 5、凝胶收缩实验：将原代大鼠肝星状细胞接种于事先制备好的胶原晶格中,待细胞贴壁后分离胶原晶格与培养板底部,施加相应刺激并孵育适当时间后,拍照并计算剩余胶原晶格面积,分析胶原晶格收缩情况。 6、免疫共沉淀实验：以10cm细胞培养皿培养原代大鼠肝星状细胞,待培养皿内细胞融合度达80%时,进行12小时饥饿处理,并给予相关药物干预,处理完成后裂解细胞并匀浆,依次进行诱饵抗体孵育、琼脂糖连接蛋白A/G孵育、离心沉淀、蛋白高温变性等处理,获得目的蛋白后,行蛋白免疫印迹实验分析目的蛋白含量改变情况。 7、免疫荧光染色实验：制备原代大鼠肝星状细胞爬片并完成相关干预后,以4%多聚甲醛固定细胞,封闭非特异性抗原,依次孵育第一抗体及第二抗体并染核封片,于荧光显微镜／共聚焦显微镜下观察并分析。 8、动物模型建立：4周龄雄性SD大鼠36只,体重为120-150g,随机等分为6组,分别行手术处理,术后24h内禁食禁水,自术后第3天起按照分组给予相应药物治疗或不做特殊处理,给药6周后宰杀全部大鼠,分别留取血清、肝脏组织,制作肝脏组织石蜡标本及冰冻标本并进行进一步研究分析。 9、免疫组织化学染色实验：制备组织石蜡切片标本,常规脱蜡、水化后进行高温抗原修复,随后依次灭活内源性过氧化物酶、封闭非特异性抗原、孵育第一抗体和第二抗体以及DAB显色,显色完成后以苏木素染核并行脱水、透明、封片处理,即可于显微镜下观察、拍照并分析结果。 10、蛋白电泳及免疫印迹实验：制备细胞或组织匀浆,完成离心、浓度测定及高温变性等步骤后,将混有上样缓冲液的总蛋白提取液加入事先制备好的丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行蛋白电泳,目的蛋白分离后,进一步进行转膜、非特异性抗原封闭以及抗体孵育,完成后以远红外成像仪检测目的蛋白荧光值并进行半定量分析。 研究结果 1、10-7M的Aldo对原代大鼠肝星状细胞内小窝蛋白cav-1和蛋白酪氨酸激酶c-src的磷酸化激活效应显著升高；原代大鼠肝星状细胞在该浓度Aldo刺激30min时,其cav-1蛋白和c-src蛋白的磷酸化激活达到峰值。 2、凝胶收缩试验示：Aldo刺激组的凝胶晶格面积明显减小,加入抑制剂干预后,凝胶晶格收缩受到抑制；细胞迁移试验中,Aldo刺激可以显著增加迁移至小室下表面的细胞数,应用抑制剂干预后,细胞迁移数目较Aldo刺激组明显减少。 3、免疫共沉淀实验提示：Aldo刺激原代大鼠肝星状细胞30min时,细胞内MR蛋白与c-src蛋白间相互作用明显增强,而Aldo刺激并并不改变cav-1蛋白与MR蛋白间相互作用关系。 4、胆固醇耗竭与重装填实验示：当耗竭原代大鼠肝星状细胞内胆固醇,即破坏小窝完整结构后,Aldo对cav-1和c-src的磷酸化激活作用受到明显抑制；而当胆固醇重装填,即恢复细胞膜小窝结构完整性后,Aldo对cav-1和c-src蛋白的磷酸化激活能力得以恢复。 5、细胞内活性氧(ROS)及过氧化氢(H202)检测实验显示：Aldo可显著促进原代大鼠肝星状细胞内ROS及H202的生成,当应用相应抑制剂干预后,Aldo的促ROS及H202生成的作用被抑制。 6、蛋白免疫印迹实验及GST-Pull Down实验示：Aldo刺激可显著增加原代大鼠肝星状细胞内NOX4蛋白表达和RhoA蛋白的激活,并进一步促进下游通路中moesin蛋白、mlc蛋白的磷酸化激活和a-SMA蛋白及胶原蛋白的合成；当应用抑制剂阻断后,相应通路下游蛋白对Aldo刺激的应答反应明显减弱。 7、体内试验对大鼠肝纤维化及药物治疗模型评估示：BDL组大鼠血清Aldo含量显著升高,肝组织内H202及羟脯氨酸含量明显增多,肝纤维化病变严重；各治疗组大鼠血清Aldo、肝组织内H202及羟脯氨酸含量均较对照组升高,但明显低于BDL组,肝纤维化病变程度介于对照组与BDL组之间。 8、肝组织免疫荧光双染示：BDL组大鼠肝内代表cav-1蛋白与a-SMA蛋白的荧光亮度显著增强,且共染定位趋向分布于肝窦、汇管区及小血管周围,各药物治疗组大鼠肝组织内共染荧光范围及亮度较BDL组明显减少。 9、肝组织免疫组化双染示：BDL组大鼠肝内NOX4蛋白与a-SMA蛋白表达显著增多,且共染色细胞趋向分布于肝窦部、汇管区等处,各药物治疗组大鼠肝组织内共染细胞数目较BDL组明显减少。 10、肝组织总蛋白免疫印迹实验及GST-Pull Down实验示：BDL组大鼠肝内cav-1蛋白、NOX4蛋白、a-SMA蛋白及collagen蛋白表达明显升高,RhoA的活化、moesin蛋白及mlc蛋白的磷酸化均明显增强,各治疗组大鼠肝内,上述蛋白表达或磷酸化水平受到不同程度抑制。 研究结论 1、Aldo可通过上调原代大鼠HSC内氧化应激水平,增加细胞内活性氧的产生而活化HSC,促进其收缩和迁移。 2、Aldo可通过小窝所介导的非基组调节途径上调原代大鼠HSC内氧化应激水平,并进一步激活HSC,促进其收缩和迁移。 3、胆管结扎可诱导大鼠血清Aldo含量、肝内氧化应激水平升高以及肝纤维化的发生,这种作用可被Aldo受体拮抗剂或抗氧化剂所抑制。4、在胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化模型中,Aldo促进小窝蛋白cav-1及氧 化应激相关蛋白NOX4(NADPH氧化酶组分)在HSC中的表达,并可活化HSC,使 其向肝窦血管、汇管区等处迁移和收缩。5、结合已有文献报道及本课题研究结果,我们推断在醛固酮经非基因组途 径激活氧化应激通路,调控大鼠肝星状细胞收缩和迁移的过程中,可能存在如 下信号转导通路：醛固酮↑→MR→c-src→cav-1→NADPH氧化酶细胞变性坏死RhoA GTPase炎症因子释放氧化应激增强Rock↓肝硬化图1：课题相关信号通路Fig1：Topics related signaling pathways
【关键词】：醛固酮 小窝蛋白 氧化应激 肝纤维化 非基因组调控
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-28
• 材料与方法28-66
• 1、主要试剂、材料与设备28-31
• 2、实验方法31-66
• 结果66-114
• 讨论114-120
• 结论120-121
• 参考文献121-127
• 成果127-128
• 致谢128-130
• 附录：英文缩略语对照表130-131

【参考文献】

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3 厉英超,苌新明,张盈涛;内皮素、胰高血糖素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮与实验性大鼠肝纤维化[J];肝脏;2001年03期

  本文关键词：醛固酮经非基因组途径激活氧化应激通路调控大鼠肝星状细胞收缩迁移的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：497029