MiR-19b调控肠上皮细胞SOCS3表达在肠粘膜损伤修复中的作用

发布时间：2017-07-14 06:01

  本文关键词：MiR-19b调控肠上皮细胞SOCS3表达在肠粘膜损伤修复中的作用

  更多相关文章： 克罗恩病 miR-19b SOCS3 p-STAT3 肠黏膜修复

【摘要】：【研究背景与目的】炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD),其病因和发病机制尚未完全明确。肠黏膜免疫紊乱是导致IBD发生、发展和影响其转归的决定性因素,而肠上皮细胞在维持肠免疫稳态中具有重要的作用。目前调控肠上皮细胞发挥肠黏膜免疫稳态功能的分子机制尚不清楚。近期研究表明,IBD患者存在特异的miRNAs表达谱,miRNA可在转录后水平抑制靶基因的表达,参与IBD的发病。细胞因子信号抑制物3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)可通过对肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC)信号传导及转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)的表达调控,介导细胞增殖过程,影响炎症过程中的粘膜愈合,是炎症持续活动的生物学标志。我们的前期研究发现miR-19b在CD患者肠粘膜组织的病变部位较正常人明显下降,而SOCS3的蛋白表达较正常人明显升高,且细胞实验验证miR-19b可以靶向调控SOCS3的表达。本课题旨在:通过小鼠结肠炎模型进一步验证miR-19b在肠道炎症形成中的作用;并通过免疫组化、miRNA原位杂交及细胞实验探讨miR-19b靶向调控肠上皮细胞SOCS3的表达对STAT3活性的影响及其对IEC增殖的作用。【方法】1.选取6~8周雌性BALB/c小鼠,给予三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)灌肠,诱导建立小鼠结肠炎模型。2.TNBS造模成功后,给予小鼠miR-19b类似物灌肠,免疫荧光检测外源性输注的miR-19b在肠粘膜中的分布,并观察各组小鼠肠道炎症的变化,检测肠组织中miR-19b及SOCS3的表达水平。3.原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)检测CD患者及正常对照组肠上皮细胞中miR-19b的表达。4.免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测CD患者及正常对照组肠上皮细胞中STAT3及磷酸化STAT3(Phosphorylated-STAT3,p-STAT3)的表达。5.荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter assay)分析HT-29细胞中miRNA与SOCS3 3’非翻译区(UTR)的结合情况。6.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,采用Western blotting及q RT-PCR分别检测SCOS3蛋白和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表达情况。7.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予Interleukin-6(IL-6)刺激细胞30min,Western blotting检测细胞STAT3及p-STAT3的表达水平。8.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予IL-6刺激细胞24h,q RT-PCR及Western blotting分别检测STAT3的下游基因细胞周期素cyclin D1的mRNA和蛋白的变化。9.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予IL-6刺激细胞24h,用流式细胞技术及CCK8检测细胞细胞周期及增殖能力的变化。【结果】1.BALB/c小鼠经TNBS灌肠后形成结肠炎模型。与乙醇对照组相比,TNBS模型组小鼠的DAI评分增加,肠道炎症加重,HE组织病理评分增加。提示造模成功。2.小鼠TNBS造模成功后,结肠中miR-19b水平较对照组降低,SOCS3蛋白表达较对照组增加。再给予miR-19b类似物灌肠,免疫荧光显示外源性输注的miR-19b可进入肠上皮细胞内。治疗组中小鼠的DAI评分较造模组有所下降,HE组织评分降低,肠道炎症减轻,提示结肠中miR-19b的水平与小鼠的肠道炎症程度成负相关。检测各组小鼠结肠组织中miR-19b及SOCS3的表达,发现经miR-19b类似物灌肠治疗后小鼠结肠中miR-19b水平升高,SOCS3蛋白降低,SOCS3 mRNA在各组小鼠结肠组织中无明显差异。提示miR-19b可以改善TNBS小鼠结肠的炎性损伤,可能与转录后调控SOCS3的表达相关。3.原位杂交结果显示miR-19b在活动期CD患者肠上皮细胞中低表达,与前期研究中PCR的检测结果一致。4.活动期CD患者病变肠上皮细胞中STAT3蛋白表达水平与正常对照组肠上皮细胞相比无明显差异,而p-STAT3的表达较对照组明显降低。5.在HT-29细胞中,荧光素酶报告基因实验结果提示miR-19b可以与SOCS3 mRNA的3’UTR特异性结合。6.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b,可降低或升高SOCS3蛋白水平,而SOCS3 mRNA水平不受影响。提示在HT-29细胞中,miR-19b可在转录后水平抑制SOCS3的表达。7.在HT-29细胞中过表达或抑制miR-19b,可升高或下降STAT3蛋白的磷酸化水平,而STAT3的总蛋白水平不受影响。8.过表达HT-29细胞中的miR-19b可促进STAT3磷酸化,可增加下游基因cyclin D1的表达;降低miR-19b可抑制STAT3的磷酸化,可减少cyclin D1的表达。9.过表达HT-29细胞中的miR-19b能够诱导细胞G1/S期转化,促进细胞增殖;下调HT-29细胞中的miR-19b则减少细胞G1/S期的转化,抑制细胞增殖。【结论】miR-19b的低表达及SOCS3的高表达存在于CD患者及TNBS诱导的结肠炎小鼠中。给予miR-19b类似物后,可减低TNBS小鼠结肠的炎性损伤,提示异常表达的miR-19b及SOCS3可能与肠道的炎症形成相关,参与CD的发病。体外细胞实验提示miR-19b可靶向调控SOCS3的表达,影响p-STAT3/cyclin D1的表达,调节细胞周期及细胞增殖,从而影响CD患者损伤肠粘膜的修复,参与CD的发生发展。
【关键词】：克罗恩病 miR-19b SOCS3 p-STAT3 肠黏膜修复
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 略缩语中英文对照表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 材料及方法16-34
• 结果34-45
• 讨论45-50
• 结论50-51
• 参考文献51-59
• 综述 miRNA在炎症性肠病的病因、诊断及治疗中的作用59-71
• 参考文献66-71
• 攻读学位期间发表论文情况71-72
• 致谢72

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 邢长英;归绥琪;;SOCS3作用机制与妇产科研究进展[J];生殖与避孕;2007年04期

2 ;Expression of SOCS-1 in the liver tissues of chronic hepatitis B and its clinical significance[J];World Journal of Gastroenterology;2008年04期

3 ;Dendritic Cells Transduced with SOCS1 Gene Exhibit Regulatory DC Properties and Prolong Allograft Survival[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年02期

4 许文频;李卫东;;SOCS3分子——治疗人类多种疾病的潜在靶标[J];药学学报;2011年07期

5 李咏;韩梅芳;李维娜;师爱超;张元亚;王宏艳;王发席;李兰;吴婷;丁琳;陈韬;严伟明;罗小平;宁琴;;SOCS3 Expression Correlates with Severity of Inflammation in Mouse Hepatitis Virus Strain 3-induced Acute Liver Failure and HBV-ACLF[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年03期

6 毛一雷,Ling P Bistrian BR,Smith RJ Joslin;新发现的SOCS蛋白家族:揭示了创伤和营养不良时代谢异常的机理[J];中国临床营养杂志;2000年01期

7 ;Gene Delivery of SOCS3 Protects Mice from Lethal Endotoxic Shock[J];Cellular & Molecular Immunology;2005年05期

8 周运恒;荣光华;杨再兴;仲人前;;SOCS及其免疫学作用研究进展[J];现代免疫学;2007年06期

9 张奇;吴健;于波;;SOCS1与免疫调节的研究进展[J];免疫学杂志;2010年11期

10 丁浩;孙国芳;李菊香;洪葵;程晓曙;;SOCS1对氧化低密度脂蛋白促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响[J];岭南心血管病杂志;2011年S1期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 Zhiyao Bao;Quirui Zhang;Huanying Wan;Min Zhou;Ping He;;Expression of SOCS-1 in the peripheral blood from patients with idiopathic pulmonary fibrosis[A];中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C];2013年

2 徐雪;李娟;王亚军;;家鸡细胞因子信号传导抑制因子(SOCS1)基因的克隆及其组织表达[A];四川省动物学会第九次会员代表大会暨第十届学术研讨会论文集[C];2011年

3 王国兵;李成荣;杨军;温鹏强;贾实磊;;SOCS1/SOCS3甲基化改变在儿童急性ITP Th17/Treg细胞失衡中的作用初探[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2012年

4 许衍硕;陈志斌;梁艳冰;唐皓;马中富;;外周血单个核细胞SOCS-1表达与MODS患者预后关系的研究[A];全国危重病急救医学学术会议论文汇编[C];2007年

5 许衍硕;陈志斌;梁艳冰;唐皓;马中富;;外周血单个核细胞SOCS-1表达与MODS患者预后关系的研究[A];2008年广东省中医热病、急症、中西医结合急救、危重病、灾害医学学术会议学术论文集[C];2008年

6 谭峰;方美凤;梁艳桂;刘晓林;陈文霖;;急性脑梗塞患者血清SOCS-3的动态变化及其意义[A];国家中医药管理局脑病重点研究室建设研讨会暨中风病科研成果推广交流会论文汇编[C];2010年

7 夏杰;步宏;石毓君;孙怀强;包骥;;部分肝切除后肝再生过程中SOCS3基因启动子甲基化检测[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年

8 陈志斌;梁艳冰;唐皓;林贤寿;何东华;马中富;;外周血单个核细胞SOCS-1与SOCS-3表达与MODS患者预后关系的研究[A];2008年广东省中医热病、急症、中西医结合急救、危重病、灾害医学学术会议学术论文集[C];2008年

9 刘霞;张永亮;安华章;徐红梅;于益芝;杨晓;曹雪涛;;SOCS3反馈抑制巨噬细胞内源性TGF-β1负向调节TLR4反应的作用和机制研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

10 李菊香;万磊;夏子荣;苏海;颜素娟;程晓曙;吴清华;;细胞因子信号抑制物SOCS1/JAB介导CT-1对心肌胞急性缺氧复氧损伤的保护作用[A];江西省第四次中西医结合心血管学术交流会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 本报特约撰稿人 陆志城;SOCS3：抗过敏反应药物的新靶标[N];医药经济报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘冰;USP18/SOCS1在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干扰素中的作用及其分子机制研究[D];北京协和医学院;2015年

2 郭飞;GATA6上调LOXL2促进胆管癌侵袭转移和FXR上调SOCS3抑制肝细胞癌增殖的研究[D];第三军医大学;2015年

3 徐安涛;SOCS3促溃疡性结肠炎肠道炎症复发的机制研究[D];上海交通大学;2015年

4 储勤军;SOCS3介导的IL6/STAT3炎症通路在结直肠癌发生发展中的作用及机制研究[D];郑州大学;2016年

5 郑君文;呼吸道合胞病毒非结构蛋白和持续感染对SOCS1/3表达的影响[D];武汉大学;2014年

6 周运恒;SOCS在原发性胆汁性肝硬化发病机制中的作用研究[D];第二军医大学;2009年

7 邢长英;补肾益气方调控人早孕滋养细胞SOCS3表达改善其生物学功能的研究[D];复旦大学;2006年

8 张沛;SOCS3在心脏移植慢性排斥反应中的作用和机制研究[D];华中科技大学;2014年

9 白莉;SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞癌基因表达的影响[D];第三军医大学;2004年

10 王晨;JAK/STAT信号通路抑制因子SOCS-1/3对糖尿病肾病作用及其机制的研究[D];河北医科大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘钰;Plko.1-SOCS3-siRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定[D];兰州大学;2015年

2 任倩;SOCS2和STAT5在喉癌中的表达及其临床意义[D];山西医科大学;2015年

3 舒禄云;SOCS3基因对子宫内膜癌细胞增殖和迁移作用的研究[D];南方医科大学;2015年

4 黄佳晏;SOCS3对IgA肾病患者IgA1刺激人肾小球系膜细胞增殖的影响及机制探讨[D];南昌大学医学院;2015年

5 徐旺;SOCS1介导AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖的作用及机制[D];南昌大学医学院;2015年

6 訾广芹;过敏性紫癜儿童SOCS表达及与Th17/Treg细胞失衡关系研究[D];青岛大学;2015年

7 张庆群;SOCS低甲基化在过敏性紫癜儿童Th17/Treg细胞失衡中的作用研究[D];青岛大学;2015年

8 钱明;EGFR重组蛋白冲击SOCS1沉默的DC对Hep-2细胞杀伤作用的研究[D];辽宁医学院;2015年

9 桂博翔;SOCS3在H9N2禽流感病毒诱发急性肺损伤及继发细菌性肺炎中的作用研究[D];华东师范大学;2016年

10 郝连旭;半滑舌鳎CC型趋化因子和SOCS的系统发育和表达模式分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2016年

，

本文编号：539877