腹膜透出液线粒体DNA含量与腹膜功能及腹膜炎预后关系的研究

发布时间：2017-07-18 02:23

  本文关键词：腹膜透出液线粒体DNA含量与腹膜功能及腹膜炎预后关系的研究

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【摘要】：第一部分透出液线粒体DNA含量与腹腔炎症状态及腹膜转运功能的关系研究目的维持性腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者腹膜局部长期处于慢性炎症状态,腹膜转运功能与炎症程度密切相关。研究证实线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)由受损或死亡细胞释放入循环后可引起炎症反应。mtDNA是否参与了PD患者腹腔慢性炎症状态目前不清楚。本研究旨在探讨腹膜透出液中mtDNA与腹腔炎症状态及腹膜转运功能之间的关系。方法选取2009年1月1日～2010年12月31日在我院接受开始维持性腹膜透析的终末期肾病患者。患者在第一次行腹膜平衡试验(PET)时留取透出液标本,荧光定量PCR法检测透出液上清液中mtDNA含量,ELISA法检测IL-6、IL-17A、TNF-α和IFN-γ水平。记录患者基本资料、实验室检查指标及生存预后资料等。应用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果符合研究纳入标准的共有189例,男性105例,女性84例,平均年龄47.1±13.5岁,中位随访时间为41.9个月。所有患者平均腹膜溶质转运率(Peritoneal solute transport rate,PSTR)为 0.66±0.12,其中高转运 18(9.5%)例,高平均转运 94(49.7%)例,低平均转运57(30.2%)例,低转运20(10.6%)例。腹膜透出液中位mtDNA含量为 4325 copies/ul,IL-6 浓度为 25.9pg/ml,IL-17A 浓度为 10.8pg/ml,TNF-α 浓度为 25.8pg/ml,IFN-y 浓度为 17.9pg/ml。mtDNA 与腹膜溶质转运率(r =0.461,P0.001)、IL-6(r = 0.568,P0.001)、TNF-α(r = 0.454,P0.001)和 IFN-γ(r = 0.203,P= 0.005)均呈正相关。广义线性回归模型中,mtDNA是IL-6的独立相关因素。女性、使用2.5%葡萄糖透析液、透析剂量、mtDNA和IL-6是PSTR的独立相关因素(P0.05)。不同mtDNA水平患者生存率无明显差异,多因素Cox回归结果显示透出液mtDNA不是患者死亡及技术失败的独立危险因素(P0.05)。结论透出液mtDNA与腹腔局部炎症程度相关,并且是PSTR的独立预测因素,但不是患者死亡和技术失败的危险因素。第二部分透出液线粒体DNA含量与腹膜炎预后的关系研究目的腹膜透析相关性腹膜炎是腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者最常见的并发症之一。尽管近年来腹膜炎发生率有所下降,但其仍是导致PD患者死亡或技术失败的重要原因。线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)能够激活免疫系统引起免疫放大反应。研究表明,循环中mtDNA水平与创伤或脓毒血症预后相关,但其在腹膜透析相关性腹膜炎中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨腹膜透出液中mtDNA含量与腹膜透析相关性腹膜炎预后的关系。方法前瞻性选取2014年6月1日～2015年9月30日发生腹膜透析相关性腹膜炎并在我院就诊的维持性腹膜透析患者。所有患者在腹膜炎第1天和第3天留取透出液标本,荧光定量PCR法检测透出液中mtDNA、细菌DNA(BacteriaDNA,bDNA)含量,ELISA法检测IL-6水平。记录患者基本信息、实验室检查指标及腹膜炎治疗结局等资料。随访期限为腹膜炎治疗后1个月,将患者分为治愈组和退出组,应用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果研究期间共发生237例腹膜炎,符合研究纳入标准的共有94例,其中男性60例,女性34例,平均年龄为54.2 ± 12.7岁,平均Charslon合并症指数评分为3.4 士1.5,中位透析龄24.9个月。第1天和第3天退出组透出液中mtDNA均显著高于治愈组(P= 0.004和P0.001);第1天两组bDNA比较差异无统计学意义(P =0.093),但第3天退出组bDNA显著高于治愈组(P0.001)。Pearson相关分析显示第3天透出液mtDNA、bDNA、IL-6、透出液白细胞及hs-CRP均呈正相关(P0.05),且相关性相比于第1天均有所提高。第1天和第3天mtDNA的AUC分别为0.772和 0.894,bDNA 的 AUC 为 0.657 和 0.827,白细胞的 AUC 为 0.472 和 0.788。根据第3天ROC曲线和约登指数最大原则,mtDNA截断值约为163000 copies/ul(约登指数0.687,灵敏度72.7%,特异度95.9%),bDNA截断值约为1700 copies/ul(约登指数0.710,灵敏度81.8%,特异度89.2%),白细胞截断值约为1220个/ul(约登指数0.596,灵敏度63.6%,特异度96.9%)。根据3个指标的截断值将变量重新分为高低两组。多元logistic回归分析结果显示mtDNA(OR = 29.363,P=0.01)和bDNA(OR= 12.151,P = 0.037)为腹膜炎治疗失败的独立危险因素。依据mtDNA和bDNA建立风险预测模型,综合风险评分(Summary Risk Score,SRS)模型公式=3.38*mtDNA(0 或 1)+ 2.497*bDNA(0 或 1)。模型 ROC 曲线下面积为 0.887(95%CI 0.742-1.000,P0.001)其预测腹膜炎治疗失败的灵敏度为72.7%,特异度为100%。结论腹膜炎患者透出液中mtDNA水平与炎症程度相关,并且是腹膜炎治疗失败的独立危险因素。利用第3天透出液mtDNA和bDNA水平预测腹膜炎预后有良好的准确度,可作为预测腹膜炎预后的新的标志物,需要大样本研究进一步证实。第三部分线粒体DNA诱导小鼠急性腹膜炎症及其作用机制初步研究目的:腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者长期处于炎症状态,反复发生和持续存在的炎症已被证实与腹膜透析的不良预后相关。线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)同细菌DNA(Bacterial DNA,bDNA)一样,含有大量未甲基化的CpG序列,能够激活TLR9(Toll-like receptor 9),引起炎症反应,造成组织器官损伤。另外,mtDNA还可能通过激活NLRP3炎症体(inflammasome),从而促进IL-1β的表达和分泌,介导炎症产生。作者研究中发现,无论在慢性PD患者还是发生急性腹膜炎的患者透出液中均检测到mtDNA水平升高,并与炎症程度呈正相关,同时影响腹膜转运功能和腹膜炎预后。为此,我们将通过动物实验进一步探讨mtDNA在腹膜炎症发生发展中的作用及其可能机制:(1)利用LPS造小鼠急性腹膜炎模型,验证mtDNA在腹膜炎的作用;(2)探讨mtDNA是否通过激活TLR9和NLRP3通路介导腹膜炎症反应和损伤。方法:选取C57BL/6健康雄性小鼠,分为7组:生理盐水组(对照组),低LPS组(2mg/kg),高 LPS组(10mg/kg),低mtDNA组(0.2mg/kg),高 mtDNA组(1mg/kg),低bDNA组(0.2mg/kg),高bDNA组(1mg/kg)。腹腔注射各组干预药物,在注射后6h和24h处死小鼠,处死前每只小鼠腹腔注射2ml生理盐水,处死后吸取腹腔灌洗液,进行白细胞计数、PCR法检测mtDNA水平、ELISA检测IL-1β和IL-6含量;切取小鼠腹壁组织、网膜和肠系膜组织,HE和Masson染色观察腹膜组织形态学改变、MitoSOX荧光检测间皮细胞内线粒体功能改变、电镜观察间皮细胞超微结构改变。RT-PCR法检测腹膜组织内TLR9和NLRP3mRNA表达水平。用SPSS 19.0和GraphPad 6.0统计软件对数据进行统计学分析。结果:注射不同剂量LPS后,在6小时腹腔灌洗液中mtDNA水平显著升高,并且注射LPS剂量越大,mtDNA水平越高。在24小时,mtDNA水平较第6小时均有所下降,但高剂量LPS组mtDNA水平仍显著高于对照组和低剂量LPS组。并且mtDNA水平与炎症程度显著相关,mtDNA浓度越高,IL-1β、IL-6水平和白细胞数量也越高。同时,注射mtDNA或bDNA6小时后,各组腹膜组织TLR9和NLRP3 mRNA表达量上调,各组腹腔灌洗液中白细胞数量、IL-1β和IL-6水平均显著高于对照组(P0.05),并且这种bDNA或mtDNA剂量呈正相关性。在24小时,腹膜组织TLR9和NLRP3 mRNA表达量较对照组有所下降,各组白细胞数量、IL-1 β和IL-6水平较第6小时下降,但仍显著高于对照组(P0.05);腹膜组织病理改变可见腹膜组织水肿增厚,大量炎症细胞浸润、腹膜间皮细胞下胶原纤维增多;电镜下可见间皮细胞形态发生改变、间皮细胞脱落、细胞内线粒体肿胀、内质网扩张改变。结论:动物实验结果验证了急性腹膜炎时可引起腹腔内mtDNA水平升高,mtDNA可能通过激活TLR9和NLRP3受体激活免疫反应信号通路,引起炎症反应,引起腹膜组织形态、病理改变及功能障碍。
【关键词】：腹膜透析 线粒体DNA 炎症 腹膜溶质转运率 预后 腹膜透析相关性腹膜炎 细菌DNA 炎症 预后 腹膜炎 线粒体DNA Toll-likereceptor9 NLRP3炎症体
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R572.2;R459.5
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 缩略对照词表18-23
• 第一部分 透出液线粒体DNA含量与腹腔炎症状态及腹膜转运功能的关系研究23-64
• 前言23-25
• 1 对象和方法25-40
• 1.1 研究对象25
• 1.2 临床资料收集25-28
• 1.3 透出液标本留取和保存28
• 1.4 主要试剂和耗材28-30
• 1.5 线粒体Cytochrome B基因质粒标准品及标准曲线制备30-35
• 1.6 腹膜透出液线粒体DNA提取与检测35-37
• 1.7 ELISA实验37-38
• 1.8 统计方法38-40
• 2 结果40-56
• 2.1 基本资料40-42
• 2.2 mtDNA和炎症因子含量及相关性42-45
• 2.3 PSTR与mtDNA、炎症因子相关性45-46
• 2.4 mtDNA、IL-6与PSTR的预测因素46-49
• 2.5 mtDNA预测腹膜转运特性效能49-50
• 2.6 生存分析50-56
• 3 讨论56-59
• 4 结论59-60
• 参考文献60-64
• 第二部分 透出液线粒体DNA含量与腹膜炎预后的关系研究64-99
• 前言64-66
• 1 对象和方法66-81
• 1.1 研究对象66
• 1.2 临床资料66-67
• 1.3 透出液标本留取和保存67
• 1.4 主要试剂和耗材67-69
• 1.5 线粒体CYTOCHROME B基因质粒标准品及标准曲线制备69-74
• 1.6 细菌16S DNA基因质粒标准品及标准曲线制备74-75
• 1.7 透出液线粒体DNA提取75-76
• 1.8 透出液细菌DNA提取76
• 1.9 腹膜透出液中游离线粒体DNA和细菌DNA含量检测76-78
• 1.10 ELISA实验78-80
• 1.11 统计方法80-81
• 2 结果81-92
• 2.1 基本信息及培养结果81-83
• 2.2 实验室指标83-86
• 2.3 不同培养结果间mtDNA、bDNA比较86
• 2.4 mtDNA、bDNA、IL-6、白细胞及hs-CRP相关性86-88
• 2.5 mtDNA、bDNA及白细胞ROC曲线比较88
• 2.6 腹膜炎预后危险因素分析88-90
• 2.7 腹膜炎预后风险预测模型90-92
• 3 讨论92-95
• 4 结论95-96
• 参考文献96-99
• 第三部分 线粒体DNA诱导小鼠急性腹膜炎症及其作用机制初步研究99-126
• 前言99-100
• 1 实验方法和材料100-109
• 1.1 研究对象100
• 1.2 主要试剂100-101
• 1.3 主要仪器设备和耗材101-103
• 1.4 动物实验方法103-108
• 1.5 统计分析108-109
• 2 结果109-120
• 2.1 LPS组腹腔灌洗液游离mtDNA含量109-110
• 2.2 LPS组腹腔灌洗液IL-1β和IL-6水平110-111
• 2.3 LPS组腹腔灌洗液白细胞数量111-112
• 2.4 LPS组腹腔灌洗液mtDNA、炎症因子和白细胞数量相关性112-113
• 2.5 bDNA和mtDNA组腹腔灌洗液IL-1β和IL-6水平113-114
• 2.6 bDNA和mtDNA组腹腔灌洗液白细胞数量114-115
• 2.7 bDNA和mtDNA组腹膜组织TLR9和NLRP3 mRNA表达115-116
• 2.8 各组腹膜组织HE和Masson染色病理表现116-118
• 2.9 各组腹膜组织线粒体氧化应激表现118
• 2.10 各组腹膜组织电镜病理表现118-120
• 3 讨论120-122
• 4 结论122-123
• 参考文献123-126
• 结语与展望126-127
• 综述127-140
• 参考文献135-140
• 作者简介140

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