SOCE相关蛋白在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤肺微血管内皮细胞中的表达和作用

发布时间：2017-07-18 21:17

  本文关键词：SOCE相关蛋白在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤肺微血管内皮细胞中的表达和作用

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【摘要】：背景:在非兴奋性细胞,细胞外钙离子最主要通过钙池操纵的钙通道(store-operated Ca2+channels,SOCs)进入细胞内,从而参与多种细胞生命活动的调节,如细胞的增殖和凋亡,因为SOCs通道在非兴奋性细胞生理作用上的特殊性和重要性,近年来越来越受到研究关注。间质相互作用因子1(stromal interaction molecule1,STIM1)是细胞内质网膜上表达的蛋白,近年来经大量的研究证明它与内质网识别细胞内钙浓度有关,钙释放激活钙通道蛋白1(Calcium release-activated calcium channel protein1,Orai1)是细胞膜上众多的钙离子通道之一,STIM1与Orai1现在已经被认定为SOCs的两个重要组成部分。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是常见急腹症,胰腺炎的胰外器官损害很常见,其中又以急性肺损伤(acute lung injury of rats,ALI)发生最为常见。近年来大量研究都证实肺微血管内皮细胞损伤在急性肺损伤发病的过程中起关键作用。目的:研究大鼠重症急性胰腺炎肺损伤过程中(store-operated calcium entry,SOCE)相关蛋白的变化及抑制soce的影响和lps刺激肺微血管内皮细胞后soce相关蛋白变化及rna干扰后的影响,探讨soce相关蛋白在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用,为临床治疗和预防重症急性胰腺炎肺损伤找到新的靶点。方法:实验一:健康雄性(spraghe-dawley,sd)大鼠30只,体重约200g,随机分为3组:假手术组(con),2-apb治疗组(2-apb+sap)和sap模型组(sap)。sap动物模型采用1.5%的去氧胆酸钠溶液(lml/kg)逆行胰胆管注射法。2-apb治疗组造模前24小时按腹腔注射2-apb(2.5mg/kg)。假手术组仅开腹轻翻胰腺后即关腹。造模24h后,各组大鼠麻醉后开腹,腹主动脉采血并取胰腺、肺组织。观察胰腺和肺组织的大体病理改变,he染色法观察肺组织及胰腺组织的病理改变,行胰腺和肺组织病理评分;取左肺组织,测定其干湿质量,计算肺组织含水量;用全自动血气检测仪进行动脉血气分析测定,计算氧合指数(pao2/fio2);采用碘-淀粉比色法并对血淀粉酶的含量进行测定;使用酶联免疫吸附测定法(elisa)检测血清tnf-α和il-6水平;采用real-timepcr测定肺组织中orai1、stim1mrna的水平;采用蛋白印迹(westernblot)法检测orai1、stim1蛋白在肺组织中的表达。实验二:实验动物、分组及造模方法同实验一。造模24h后,各组大鼠麻醉下开腹,取肺组织。采用免疫荧光法检测肺微血管上皮细胞orai1、stim1蛋白的表达;采用末端脱氧核甘酸转移酶介导dutp缺口末端标记方法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddutp-biotinnick-endlabeling,tunel)检测大鼠肺微血管上皮细胞凋亡的情况;应用透射电镜观察大鼠肺微血管内皮细胞超微结构变化;采用real-timepcr检测肺组织中bax、caspase3mrna的水平。实验三:由pricells公司购进的大鼠肺微血管内皮细胞系,经复苏、培养、传代,于第五代开始用于实验。根据在genebank中检索的大鼠stim1、orail基因序列,设计、合成3对针对大鼠stim1、orail基因的小干扰rna序列,应用阳离子脂质体2000转染大鼠肺微血管内皮细胞。培养大鼠肺微血管内皮细胞,应用negativecontrolfam小干扰rna序列转染大鼠肺微血管内皮细胞,48h后应用免疫荧光法检测小干扰rna序列转染效率;培养大鼠肺微血管内皮细胞共分8组;mock组(只加阳离子脂质体2000,不加小干扰rna序列);negativecontrol干扰组;stim1干扰组1;stim1干扰组2;stim1干扰组3;orail干扰组1;orail干扰组2;orail干扰组3。转染48h,应用real-timepcr方法验证其对stim1、orail表达抑制的有效性,挑选抑制效应最强的小干扰rna序列进行下一步实验。培养大鼠肺微血管内皮细胞分为5组:空白对照组(blank),培养基持续培养72h;lps刺激组,培养基持续培养48h,加入lps(100ng/ml)继续剌激24h;stim1干扰组:使用阳离子脂质体2000转染相应的sirna,转染48h后,加入lps(100ng/ml)继续剌激24h;orai1干扰组:使用阳离子脂质体2000转染相应的sirna,转染48h后,加入lps(100ng/ml)继续剌激24h;nfatc3抑制剂组,培养基持续培养48h,加入lps(100ng/ml)和inca-6(1.0um)继续剌激24h。各组细胞用药物作用24h后,以mtt检测法检测细胞存活率;以tunel检测法检测细胞凋亡比率;以westernblot检测法检测细胞stim1、orai1蛋白表达水平;以realtime-pcr法检测肺微血管内皮细胞中stim1、orai1、nfatc3、bax和caspase3mrna的水平变化。结果:实验一:与con组相比,sap组胰、肺组织病理损伤明显,病理评分增高;肺组织含水量升高,氧合指数降低;血清淀粉酶、tnf-α和il-6含量升高;肺组织中stim1和orai1mrna和蛋白表达水平明显增高,差异有统计学意义(p0.05)。与sap组相比,2-apb治疗组的胰、肺病理损伤较轻,病理评分降低;肺组织含水量降低,氧合指数升高;血清淀粉酶、tnf-α和il-6含量降低;肺组织中stim1和orai1mrna和蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(p0.05)。实验二:与con组相比,sap组肺微血管上皮细胞orai1、stim1蛋白的表达明显升高;肺微血管内皮细胞凋亡比率增加;肺组织中bax、caspase3mrna的水平明显增高,差异有统计学意义(p0.05);肺微血管内皮超微结构损伤明显。与sap组相比,2-apb治疗组的肺微血管上皮细胞orai1、stim1蛋白的表达明显降低;肺微血管内皮细胞凋亡比率降低;肺组织中bax、caspase3mrna的水平降低,差异有统计学意义(p0.05);肺微血管内皮超微结构损伤减轻。实验三:免疫荧光检测小干扰rna序列转染效率约80%;筛选出针对大鼠stim1、orail的小干扰rna序列各一条,real-timepcr验证可有效抑制stim1、orailmrna转录水平,抑制效率在70%以上。与blank组比较,lps组肺微血管内皮细胞细胞存活率降低、凋亡比率升高;细胞中stim1、orai1转录及表达水平升高,nfatc3、bax和caspase3mrna的水平增高,差异有统计学意义(p0.05)。与lps组比较,lps+stim1干扰组,lps+orai1干扰组,lps+inca-6组肺微血管内皮细胞细胞存活率升高、凋亡比率降低;细胞中nfatc3、bax和caspase3mrna的水平降低,差异有统计学意义(p0.05)。结论:1.采用胆胰管逆行注射去氧胆酸钠制备sd大鼠急性胰腺炎肺损伤的模型,可以成功的模拟重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的症状。2.大鼠重症急性胰腺炎肺损伤过程中,肺组织stim1、orai1转录及表达水平升高,应用SOCE抑制剂2-APB后,STIM1、Orai1转录及表达水平下调且肺损伤指标缓解,提示SOCE在急性胰腺炎肺损伤中发挥重要作用。3.SOCE参与急性胰腺炎肺损伤可能与调控肺微血管内皮细胞凋亡有关。4.SOC抑制剂的急性胰腺炎肺损伤的保护作用可能是通过抑制线粒体介导凋亡相关。5.LPS刺激可增高STIM1、Orail表达,从而加重肺微血管内皮细胞损伤。6.针对STIM1及Orail的RNA干扰可能通过抑制STIM1-Orai1-CaN-NFAT信号通路,下调Bax、caspase3等因子的表达而减轻肺微血管内皮细胞损伤。
【关键词】：重症急性胰腺炎 急性肺损伤 肺微血管内皮细胞 STIM1 Orai1 RNA干扰
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576
【目录】：

• 中文摘要10-15
• 英文摘要15-18
• 第一部分 SOCE相关蛋白参与重症急性胰腺炎诱导的急性肺损伤18-41
• 一、前言18-19
• 二、材料19-22
• （一）实验动物19
• （二）主要仪器与设备19-20
• （三）试剂与药品20-22
• 三、方法22-32
• （一）动物模型的制备22
• （二）标本采集方法22-23
• （三）各检测指标及方法23-32
• 1. 胰腺、肺组织病理观察评分23
• 2. 血清淀粉酶含量测定23-24
• 3. 血清IL-6、TNF-ɑ 测定检测24-25
• 4. 氧和指数测定25
• 5. 肺组织含水量测定25
• 6. 肺组织Orai1、STIM1 mRNA的检测25-28
• 7. 肺组织Orai1、STIM1蛋白的检测28-31
• 8. 统计方法31-32
• 四、结果32-36
• （一）SAP 大鼠模型制备后，大鼠一般情况和组织病理改变及病理评分32-33
• 1、各实验组大鼠造模 24h 后一般情况变化32
• 2、各实验组大鼠胰腺和肺组织观察32
• 3、各实验组大鼠胰腺和肺组织光镜下病理改变观察32-33
• （二）各组大鼠血清淀粉酶含量的变化33
• （三）各组大鼠血清 IL-6、TNF-ɑ水平的变化33-34
• （四）各组大鼠氧和指数变化34
• （五）各组大鼠肺含水量变化34-35
• （六）Orai1、STIM1 m RNA 在肺组织中表达水平的变化35
• （七）肺组织中 Orai1 、STIM1 蛋白的检测结果35-36
• 五、讨论36-40
• 六、小结40-41
• 第二部分 抑制SOCE降低重症急性胰腺炎肺损伤PMVEC凋亡41-58
• 一、前言41-42
• 二、材料42-44
• （一）实验动物42
• （二）主要仪器与设备42-43
• （三）试剂与药品43-44
• 三、方法44-51
• （一）动物模型的制备44-45
• （二）标本采集方法45
• （三）各检测指标及方法45-51
• 1. 肺微血管内皮细胞orai1、STIM1蛋白表达45-46
• 2. 肺微血管内皮细胞凋亡的检测46-47
• 3.肺微血管内皮细胞超微结构观察47-48
• 4. 肺组织Bax、caspase3mRNA的检测48-50
• 5. 统计学方法50-51
• 四、结果51-55
• （一）重症急性胰腺炎大鼠模型制备后，，观察大鼠一般情况和组织病理改变（同第一部分）51
• （二）肺微血管内皮细胞 Orai1、STIM1 蛋白表达免疫荧光检测51-52
• （三）肺微血管内皮凋亡TUNEL检测52-53
• （四）肺微血管内皮超微结构透射电镜观察53-54
• （五）Bax 和 caspase3 m RNA 在肺组织中表达水平的变化54-55
• 五、讨论55-57
• 六、小结57-58
• 第三部分 SOCE相关蛋白RNA干扰对LPS刺激PMVECs的影响58-96
• 一、前言58-59
• 二、材料59-62
• （一）实验所需细胞器59
• （二）主要仪器与设备59-60
• （三）试剂与药品60-61
• （四）配制试剂61-62
• 三、方法62-74
• （一）设计合成针对大鼠肺微血管内皮细胞的 STIM1 和 Orail 基因的 RNA 干扰序列62
• （二）肺微血管内皮细胞培养62-64
• 1. 大鼠微血管内皮细胞复苏62
• 2. 大鼠微血管内皮细胞传代62-63
• 3. 大鼠微血管内皮细胞冻存63
• 4. 大鼠微血管内皮细胞计数63-64
• 5. 大鼠微血管内皮细胞刺激64
• （三）应用阳离子脂质体 2000 介导大鼠肺微血管内皮细胞 STIM1 和 Orail 基因的 RNA 干扰序列的转染64-65
• 1. 大鼠微血管内皮细胞准备64
• 2.配制大鼠肺微血管内皮胞 RNA 干扰序列与阳离子脂质体 2000 复合物64-65
• 3.RNA 干扰序列转染大鼠肺微血管内皮细胞65
• （四）Real-time PCR检测RNA干扰抑制效率65-68
• （五）大鼠微血管内皮细胞实验分组68-69
• （六）MTT 实验检测 RNA 干扰对 LPS 诱导肺微血管内皮细胞损伤的影响69
• （七）Real-time PCR 法测定 Orai1，STIM1，NFATC3，Bax 和 caspase3 转录的水平69-70
• （八）肺微血管内皮细胞Orai1、STIM1蛋白的检测70-73
• （九）肺微血管内皮细胞凋亡的检测73-74
• （十）统计学方法74
• 四、结果74-79
• （一）RNA 干扰序列转染大鼠微血管内皮细胞中的效率检测74-75
• （二）RNA 干扰序列转染大鼠微血管内皮细胞后对相应基因转录的抑制检测75-76
• （三）STIM1 及 Orail 的 RNA 干扰对 LPS 诱导肺微血管内皮细胞损伤的影响76
• （四）Real-time PCR 检测各组肺微血管内皮细胞 STIM1、Orail、NFAc3 、Bax 和 caspase3 转录的水平76-78
• （五）Western blot 检测各组肺微血管内皮细胞 STIM1、Orail 表达的水平78
• （六）TUNEL 检测各组肺微血管内皮细胞凋亡水平78-79
• 五、讨论79-84
• 六、小结84-85
• 参考文献85-96
• 综述96-106
• 参考文献102-106
• 攻读学位期间发表文章情况106-107
• 致谢107-108

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1 王冠宇;SOCE相关蛋白在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤肺微血管内皮细胞中的表达和作用[D];大连医科大学;2016年

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