建立瞬时转染细胞模型检测乙型肝炎病毒表型耐药

发布时间：2017-07-18 23:00

  本文关键词：建立瞬时转染细胞模型检测乙型肝炎病毒表型耐药

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【摘要】：目的1建立一种基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法,并评价该方法的应用价值。2使用表型耐药检测技术对体外准种群进行耐药分析,探讨突变株比例不同的HBV准种群的耐药规律性。方法1建立基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法在入选CHB患者标本中筛选出含HBV野生株及突变株的血清标本各1例,并从中分离HBV DNA,使用全基因扩增技术在体外大量扩增HBV全基因组。利用Bsp Q I酶对真核表达载体p HY106以及包含HBV全基因组的p EASY-Blunt T载体进行酶切消化,并经连接、转化等步骤从单克隆菌落中筛选出正确连接HBV全基因组的转化子,构建重组真核表达载体p HY-CL与p HY-ZJ。大量提取重组质粒载体,并将上述两组质粒瞬时转染至Hep G2细胞中,细胞培养后检测培养体系上清液中HBV DNA,以验证瞬时转染细胞模型的成功构建。以相同的转染方法分别转染两组质粒并在转染后的培养体系中,添加拉米夫定溶液使体系终浓度分别达到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM,测定在各种药物浓度下HBV DNA水平的改变并计算出IC50,以评价HBV野生株与突变株的药物敏感性。2 HBV准种群的表型耐药检测与耐药规律性分析使用定点突变方法诱导野生型重组质粒产生rt M204V点突变,将野生型质粒和经点突变的rt M204V突变型质粒混合,突变型质粒所占比例设定为0%、20%、40%、60%、80%、100%,以完成构成体外逆转录酶区准种群。不同比例组成的准种群分别转染至Hep G2细胞中,检测在各种药物浓度下HBV DNA水平的改变,并计算出各准种群的IC50。探讨不同比例组成的HBV准种群在体外表型耐药的变化规律,评价表型耐药检测技术在HBV准种群耐药检测领域的应用价值。结果1成功建立了基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法在体外大量扩增HBV全基因组,并与真核表达载体p HY106相连接。结果表明成功构建了包含HBV野生株和突变株基因组的重组载体,且基因组序列与插入方向准确无误。将上述2种重组载体转染至Hep G2细胞后在培养体系上清液中可检出高拷贝的HBV DNA,证实了瞬时转染细胞模型的成功构建。再次将野生型及突变型质粒转染至Hep G2细胞中,在培养体系中添加不同浓度的LMV使得终浓度达到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM,检测相应药物浓度下HBV DNA水平,并计算IC50,结果显示野生型和突变型质粒的IC50分别为0.024μM与1.75μM,突变型质粒的IC50较野生型增加了73倍,在体外达到耐药水平。2 HBV准种群的表型耐药检测成功使用定点突变技术,对野生型重组质粒进行rt M204V点突变改造,结果能保证非RT区以外的剩余HBV基因组序列不发生任何改变。将突变型质粒比例为0%、20%、40%、60%、80%、100%的体外准种群转染至Hep G2细胞中,IC50测定表明随着突变株在准种群内所占比例增大,IC50值亦显著增加,其中尤其以突变株占20%~40%的比例区间增加最为显著,该区间的细化分组试验亦能验证了这一结论,并提示HBV耐药性可在突变型比例达到25%~30%时形成。上述研究结果均揭示了HBV准种群中的野生株和突变株的比例组成与耐药发生相关,突变株比例增高可引发耐药,且准种群形成耐药的比例区间处于25%~30%的比例区间之内。结论1成功建立瞬时转染细胞模型介导的表型耐药检测方法,该方法可直观、准确地反映HBV的耐药情况以及其程度,可用于临床耐药的监测以及耐药规律性研究。2成功将表型耐药检测技术用于体外准种群的耐药分析,结果显示准种群内的比例组成与耐药发生密切相关,突变型所占比例达到25%~30%时可能导致耐药产生。
【关键词】：乙型肝炎病毒 表型耐药 突变 准种
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 缩略词表3-4
• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-14
• 第一部分 建立基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法14-41
• 材料和方法14-28
• 1. 研究对象14-15
• 2. 主要试剂与仪器15-17
• 3. 方法17-28
• 结果28-37
• 1. HBV全基因组的扩增.28
• 2. HBV全基因组的TA克隆28-30
• 3. 含 1.1 倍HBV全基因组重组载体的构建.30-33
• 4. 瞬时转染细胞模型的建立33-35
• 5. 表型耐药检测35-37
• 讨论37-41
• 第二部分HBV突变株比例不同的准种群耐药规律性的研究41-56
• 材料和方法41-45
• 1. 研究对象41
• 2. 主要试剂与仪器41-43
• 3. 方法43-45
• 结果45-52
• 1. 定点突变构建rtM204V重组质粒45-46
• 2. 体外准种群的表型耐药检测46-52
• 讨论52-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-61
• 综述61-71
• 参考文献67-71
• 致谢71

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本文编号：560112