基于转运体和胆酸盐的异烟肼和对乙酰氨基酚肝损伤机制初探

发布时间：2017-07-27 09:29

  本文关键词：基于转运体和胆酸盐的异烟肼和对乙酰氨基酚肝损伤机制初探

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【摘要】：目的基于肝细胞膜转运体和胆酸盐(bile acids,BAs)变化分别初步探讨异烟肼(isoniazid,INH)及对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)致大鼠肝脏损伤的机制。方法1、运用LC-MS/MS建立同时测定大鼠血液、肝脏、胆汁和尿液中15种BAs的方法。2、Wistar雄性大鼠14只随机分为2组,即INH肝损伤组(INH组)与对照组(Control组),每组7只,Control组:灌胃给予等容量的生理盐水;INH组:灌胃给予INH 100 mg/kg/d。给药第60天时,将大鼠禁食12 h,称重,胆管插管接取胆汁10 min,所得胆汁用于15种BAs的分析测定;腹主动脉采血约5mL,离心,吸取上清,测定血浆中各项生化指标与各种BAs;将部分肝脏组织浸泡于10%的甲醛中,石蜡包埋后观察肝脏病理学变化,部分肝脏组织样品用于相关转运体及BAs的测定。3、Wistar雄性大鼠14只,随机分为2组,即APAP组与对照组(Control组),每组7只,Control组:灌胃给予等容量的生理盐水;APAP组:灌胃给予APAP 500 mg/kg。单次给药后大鼠禁食12 h,称重,接取胆汁,用于15种BAs的分析测定;腹主动脉采血,测定血浆中各项生化指标与各种BAs;将部分肝组织浸泡于10%的甲醛中,石蜡包埋后观察肝脏病理学变化,部分肝脏组织样品用于相关转运体和代谢酶及BAs的测定。结果1、使用Agilent HC-C18色谱柱,21分钟完成BAs的测定;检测范围为4.30ng/mL~200μg/mL;BAs在血浆、肝脏组织、胆汁和尿液基质中的日内/间准确度LQC、MQC和HQC变化范围均在80%~104%之内,精密度RSD值均小于15%;回收率均高于80%;稳定性可靠。2、INH组给药60天与Control组相比,其部分血浆生化指标呈显著上升的趋势;大鼠血浆中的鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛黄胆酸(TCA)和石胆酸(LCA)的含量明显升高(P0.05);胆汁中的TUDCA、UDCA,TDCA和脱氧胆酸(DCA)的含量明显降低(P0.05);肝脏组织中的胆酸(CA)、TCDCA、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)和甘氨石胆酸(GLCA)的含量明显升高(P0.05);INH组较Control组多药耐药蛋白2(Mrp2)、多药耐药相关蛋白4(Mrp4)和有机阴离子转运多肽(Oatps)的蛋白表达水平均明显降低(P0.05),胆盐外排泵(Bsep)和Na+-牛磺酸共转运多肽(Ntcp)表达水平均无显著差异(P0.05)。3、APAP组给药24h,与Control组相比,其部分血浆生化指标呈显著上升的趋势;血浆中的DCA、LCA、TDCA、GDCA和GLCA的含量明显升高(P0.05);大鼠胆汁中的CDCA、GDCA、DCA和GLCA的含量明显升高(P0.05),TUDCA含量明显降低(P0.05);肝组织中DCA、GDCA、LCA和GLCA的含量明显升高(P0.05);肝组织中Mrp4和Oatp2蛋白表达水平显著降低(P0.05);Mrp2、Bsep和Ntcp的蛋白表达水平无明显变化(P0.05);Cyp7a1蛋白表达水平明显升高(P0.05)。结论1、所建立的同时测定大鼠血液、肝脏、胆汁和尿液中15种BAs的方法灵敏度和特异性较高、分析时间较短且精密度和准确度较高。2、INH导致大鼠肝损伤的机制可能与其降低肝脏Mrp2、Mrp4和Oatp2的表达水平,引起部分BAs在大鼠体内的蓄积有关;3、APAP导致大鼠肝损伤的机制可能与其降低肝脏Mrp4和Oatp2的水平,增加Cyp7a1的表达水平,引起部分BAs在大鼠体内的蓄积有关;
【关键词】：异烟肼 对乙酰氨基酚 肝毒性 转运体 胆酸盐 多药耐药蛋白2 多药耐药蛋白4 胆盐输出泵 有机阴离子转运蛋白2 Na~+-牛磺酸共转运多肽
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 药物性肝损伤11
• 1.2 异烟肼肝损伤机制11-13
• 1.3 对乙酰氨基酚肝损伤机制13-14
• 1.4 胆酸盐在肝损伤中的作用14-16
• 1.5 肝脏转运体系统16-17
• 1.6 小结17-18
• 第二章 实验材料与方法18-24
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 动物18
• 2.1.2 仪器18-19
• 2.1.3 药品与试剂19-20
• 2.1.4 抗体20
• 2.2 实验方法20-24
• 2.2.1 药物的配制20
• 2.2.2 样本采集和处理20
• 2.2.3 切片制备20-21
• 2.2.4 免疫印迹21-23
• 2.2.5 实验结果统计23-24
• 第三章 大鼠肝脏、胆汁、血液和尿液中胆酸盐测定的LC/MS-MS方法建立24-41
• 3.1 引言24-25
• 3.2 实验设计25-28
• 3.2.1 实验仪器25
• 3.2.2 色谱、质谱条件25-26
• 3.2.3 标准溶液和工作液的配制26
• 3.2.4 样品制备26-27
• 3.2.5 方法验证27-28
• 3.2.6 动物实验研究28
• 3.3 结果与讨论28-40
• 3.3.1 方法优化28-34
• 3.3.2 方法学验证34-35
• 3.3.3 胆酸盐测定结果35-40
• 3.4 小结40-41
• 第四章 基于转运体和胆酸盐的异烟肼肝损伤机制初探41-50
• 4.1 引言41
• 4.2 实验设计41-42
• 4.2.1 给药及分组41-42
• 4.2.2 色谱、质谱条件42
• 4.2.3 标准溶液和工作液的配制42
• 4.2.4 样品制备42
• 4.2.5 免疫印迹42
• 4.2.6 切片制备42
• 4.2.7 生化指标测定42
• 4.3 结果42-48
• 4.3.1 血浆生化指标变化42
• 4.3.2 肝组织病理学变化42-43
• 4.3.3 血浆、肝脏组织和胆汁中胆盐的变化43-47
• 4.3.4 肝脏组织中转运体的表达变化47-48
• 4.4 讨论48-49
• 4.5 小结49-50
• 第五章 基于转运体和胆酸盐的对乙酰氨基酚肝损伤机制初探50-59
• 5.1 引言50
• 5.2 实验设计50-51
• 5.2.1 给药及分组50
• 5.2.2 色谱、质谱条件50
• 5.2.3 标准溶液和工作液的配制50
• 5.2.4 样品制备50-51
• 5.2.5 免疫印迹51
• 5.2.6 切片制备51
• 5.2.7 生化指标测定51
• 5.3 结果51-56
• 5.3.1 血浆生化生化指标的变化51
• 5.3.2 肝脏病理学变化51
• 5.3.3 长期给药后肝脏组织、胆汁和血浆中胆酸盐的变化51
• 5.3.4.肝脏转运体的表达变化51-56
• 5.4 讨论56-57
• 5.5 小结57-59
• 第六章 研究结论59-60
• 6.1 主要结论59
• 6.2 研究中有待解决的问题59-60
• 参考文献60-67
• 在学期间的研究成果67-68
• 致谢68

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本文编号：580778