肠道上皮细胞来源的exosome在肠道免疫平衡维持中的功能及其机制研究

发布时间：2017-07-29 19:05

  本文关键词：肠道上皮细胞来源的exosome在肠道免疫平衡维持中的功能及其机制研究

  更多相关文章： Exosomes 肠道免性疫耐受 炎症肠病 TGF-β1

【摘要】：肠道是人体最大的免疫耐受器官,对大量的食物抗原和肠道菌群进行耐受。然而,肠道免疫耐受的潜在机制至今仍然不是很清楚。一系列因素的相互作用形成了一个精细复杂的调节网络,调节肠道的免疫稳态,这些因素包括调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)、DC、CD8+T 细胞、yδT 细胞、调节性 B 细胞、IgA、肠道共生菌群和大量细胞因子如TGF-β1和IL-10。而一旦肠道免疫耐受被打破,就会导致肠道的自身免疫性疾病,如IBD。IBD是一种最常见的肠道免疫失衡性疾病之一。炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)又称肠炎,是一组肠道炎症性疾病的统称。炎症性肠病的主要分为克罗恩病和溃疡性结肠炎两类[18]。由于其具有反复发作的特性,IBD病人的病情控制并不乐观,所以深入探讨肠道免疫耐受对于研究治疗IBD的新策略具有重要意义。Exosome是由活细胞分泌的、具有直至双分子层、大小在50-100nm之间的生物活性小囊泡。它们是由胞内的多囊泡体出芽、融合,再向胞外释放。如今已有多项研究证实,exosome在免疫系统中扮演着多重角色,它既能抑制免疫反应、又能正向促进免疫反应的发生。我们已经知道,肠道上皮细胞能够分泌MHC-Ⅱ+A33+exosome,而且在给大鼠喂食特定的抗原之后,其血清中会短暂地出现类似exosome的囊泡,人们将其命名为tolerosome。本课题旨在探究来自小鼠肠道的exosome是否参与了肠道免疫耐受的维持,同时以exosome为视角来解释肠道免疫耐受的机制。首先我们将从肠道获取的exosome进行鉴定,我们的结果表明来自小肠的exosome(Exosomes from Small Intestine,Si-EXO)和大肠来源的 exosome(Large Intestine,Li-EXO)都是 MHC-Ⅱ、CD11c 和 A33 阳性的,说明肠道 exosome 主要是由肠道树突状细胞(Dendritic Cell,DC)和肠道上皮细胞(Intestinal Epithelial cell,IEC)分泌的。为了进一步对提取的exosome进行鉴定,我们采用了蔗糖密度梯度离心法进行检测,结果显示,HSP70和A33这两个蛋白质集中在1.09-1.17g/ml 之间,提示 exosome 的密度在 1.09-1.17g/ml 之间。这两种 exosome都高表达TGF-β 1,暗示其具有免疫抑制效应。接下来我们在体外检测了其免疫抑制的功能,结果表明这两种exosome在体外都能够抑制CD4+T细胞的增殖,而且是浓度梯度依赖的。为了区分具体是DC还是IEC来源的exosome发挥免疫抑制效应,我们用CD11c+磁珠分选出CD11c+和CD11c+ Li-EXO,并对这两群exosome进行鉴定。结果显示肠道上皮细胞来源的Li-EXO发挥了免疫抑制效应。为了证实TGF-β 1在A33+ Li-EXO的免疫抑制效应中发挥的作用,我们预先用一种强效的、具有选择性的TGF-β受体Ⅰ抑制剂SB525334处理CD4+T细胞,然后再和A33+Li-EXO进行孵育。实验结果显示,在阻断了 TGF-β 1信号通路之后,A33+Li-EXO对CD4+T细胞的增殖抑制效果完全消除了,由此说明A33+Li-EXO通过TGF-β 1信号抑制CD4+T细胞的增殖。我们采用DSS诱导小鼠炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)模型,研究分离出来的肠道exosome是否在体内参与肠道免疫耐受。在给小鼠回输A33+Li-EXO之后,我们观察到随着回输A33+Li-EXO的浓度增加,小鼠体重减轻的趋势得到了缓解。A33+ Li-EXO在体内和体外都能够诱导CD4+Foxp3+ Treg的分化。为了明确A33+Li-EXO在体内通过诱导了 CD4+Foxp3+Treg而发挥缓解小鼠IBD,我们用Anti-CD25小鼠单抗在体内部分敲除CD4+Foxp3+ Treg,结果显示A33+Li-EXO缓解IBD的效果减弱了,说明Treg参与了 A33+Li-EXO缓解IBD的过程。此外,来自IBD小鼠的Li-EXO(IBD-Li-EXO)比健康小鼠的Li-EXO(Ctrl-Li-EXO)含有更高水平的TGF-p1。因此,无论在体内还是体外,IBD-Li-EXO免疫抑制功能和缓解IBD方面都比Ctrl-Li-EXO更强。此外,我们还发现A33+Li-EXO能够显著地抑制LPS刺激DC后IL-12的分泌水平,同时在混合淋巴细胞反应中抑制了 T细胞的增殖,我们采用了 DC功能缺陷的CD11c-DTR小鼠建立IBD模型,经A33+ Li-EXO处理后,注射白喉毒素的CD11c-DTR小鼠经DSS诱导IBD后,其体重减轻的程度明显比野生型的小鼠更高,更好地说明了A33+Li-EXO通过调节DC的功能缓解了小鼠IBD。而我们用中性鞘磷脂酶抑制剂Spiroepoxide在体内抑制exosome的分泌之后,小鼠IBD症状加重,在经过spiroepoxide处理的DSS诱导IBD小鼠上回输外源性Li-EXO后,spiroepoxide增强小鼠对DSS诱导的IBD的易感性的效应消失了。结果表明,Spiroepoxide能够抑制小鼠肠道exosome的分泌,因而增强了小鼠对DSS诱导的IBD的易感性。此外,有趣的是,我们发现,A33+ Li-EXO特异性地定居于肠道中,说明这群exosome只在肠道局部发挥作用。除了 Li-EXO,其他几种器官来源的exosome都不表达A33,而且将外源性A33+ Li-EXO回输到体内后大部分都停留在胃、小肠、大肠和肠系膜淋巴结等胃肠道组织中,这些结果表明A33+Li-EXO具有器官特异性,在胃肠道局部发挥作用。在本课题中,我们发现肠道上皮细胞分泌了具有免疫抑制效果的exosome,这些exosome能够缓解DSS诱导的小鼠IBD,这些结果意味着肠道exosome参与了肠道免疫耐受的维持。我们的研究结果为解释肠道免疫耐受提供了一种新的机制,同时,也提示增加肠道exosome的分泌可能对矫正肠道免疫平衡有积极的作用,为治疗IBD等肠道免疫失衡疾病提供了新思路。
【关键词】：Exosomes 肠道免性疫耐受 炎症肠病 TGF-β1
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574
【目录】：

• 致谢5-7
• 序言7-11
• 中文摘要11-14
• ABSTRACT14-18
• 缩略词表18-23
• 1. 引言23-28
• 2. 材料与方法28-37
• 2.1. 实验材料28-30
• 2.1.1. 实验动物与细胞系28
• 2.1.2. 实验试剂28-29
• 2.1.3. 主要溶液的配制29
• 2.1.4. 主要实验仪器29-30
• 2.1.5. 引物序列30
• 2.2. 实验方法30-37
• 2.2.1. Exosome的提取和鉴定30-31
• 2.2.2. Exosome的电镜观察31
• 2.2.3. Exosome的Western blot和流式分析31-32
• 2.2.4. T细胞增殖分析32
• 2.2.5. 大肠来源的exosome (Li-EXO)的纯化分析32
• 2.2.6. CD4~+Foxp3~+Treg分析32-33
• 2.2.7. IBD小鼠模型的诱导和A33~+ Li-EXO处理33
• 2.2.8. DC功能检测33-34
• 2.2.9. 组织病理学鉴定34
• 2.2.10. 体内和体外exosomes分泌的抑制34-35
• 2.2.11. 共聚焦显微镜35
• 2.2.12. 小鼠基因型鉴定PCR方法35-36
• 2.2.13. 统计学处理36-37
• 3. 实验结果37-87
• 3.1. 小鼠肠道能够分泌高表达TGF-B1的EXOSOMES37-41
• 3.2. 来自肠道上皮细胞的LI-EXO在体外通过TGF-B1抑制了CD4~+T细胞的增殖41-51
• 3.3. A33~+ LI-EXO通过TGF-B1信号通路缓解了DSS诱导的小鼠IBD的症状51-59
• 3.4. A33~+LI-EXO通过诱导TREGS来缓解DSS诱导的小鼠IBD的症状59-68
• 3.5. DC参与了A33~+LI-EXO缓解DSS诱导的小鼠IBD的过程68-74
• 3.6. 抑制体内EXOSOMES的分泌会增加小鼠对DSS诱导的IBD的易感性74-79
• 3.7. A33~+LI-EXO特异地在胃肠道发挥作用79-87
• 4. 讨论87-90
• 5. 结论90-96
• 参考文献91-96
• 综述: 肠道免疫耐受机制研究进展96-110
• (综述)参考文献105-110
• 作者简历110

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