PrxⅥ在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肺内的表达变化

发布时间：2017-08-06 11:08

  本文关键词：PrxⅥ在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肺内的表达变化

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【摘要】：肝脏是机体内重要的代谢器官,不仅参与蛋白质、脂肪等重要物质代谢,还具有排泄、分泌、解毒等功能。因此,肝功能发生异常不仅会导致代谢紊乱还会引起其他重要器官的功能受损。肝脏的缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝脏外科手术如肝脏移植、肝部分切除等过程中经常遇到的病理生理现象。有研究表明:HIRI的发生是导致肝功能衰竭,手术失败,病人愈后较差的重要原因。HIRI的主要损伤机制为缺血再灌注时产生的大量活性氧族(reactive oxygen species:ROS)对肝脏组织细胞的过氧化损害。ROS主要包括超氧阴离子(O2-.),过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH.)等。ROS的化学性质非常活泼,可以与细胞内和胞膜的重要结构蛋白、功能蛋白发生过氧化反应,改变细胞膜的结构,影响细胞功能,甚至引起细胞和组织死亡。肺脏是机体内对氧含量非常敏感的脏器之一,当HIRI发生时,是否会引起远端脏器肺脏也处于氧化应激状态,遭受过氧化损伤?Prx VI是近几年发现的一类过氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成员之一。Prx VI在哺乳动物肺部尤其是肺泡II型上皮细胞表达非常丰富。研究表明:Prx VI具有谷胱甘肽过氧化物酶的生物活性,其功能主要是负责还原H2O2和磷脂过氧化物等。用高浓度氧、百草枯、H2O2等物质处理大鼠肺上皮细胞引起氧化应激反应后,Prx VI的m RNA和蛋白水平会明显增强。当诱导Prx VI在肺上皮细胞系过表达时,能明显增强细胞分解H2O2的能力,抑制细胞过氧化反应的发生。说明:Prx VI在清除ROS,防止肺组织过氧化损伤中可能发挥重要作用。当肝脏缺血再灌注损伤发生后,Prx VI的表达水平如何改变?未见报道。本研究通过无损伤血管夹夹闭通往大鼠肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂30 min后松开血管夹,制造大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,然后观察大鼠肺内MDA水平,Prx VI的m RNA和蛋白表达水平。探讨肝脏缺血再灌注损伤后肺内的氧化应激状态以及Prx VI的抗氧化作用目的:观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肺内的氧化应激水平以及Prx VI m RNA和蛋白表达水平的改变,探讨其在肺内氧化应激反应中发挥的作用。方法:1肝脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材选用健康雄性Wistar大鼠,体重200±10g,由河北医科大学实验动物中心提供。随机分为对照组(Con)和缺血再灌注损伤组(HIRI),用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.5ml/kg),参照Kohli等人的方法,分离肝血管和胆管蒂,以无创伤性血管夹夹闭通往肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂。30分钟后去掉血管夹,恢复肝脏血液供应,制造70%肝实质的肝脏缺血再灌注损伤模型。对照组大鼠只分离血管和胆管蒂并不夹闭。6小时后收集血液,用于ALT(丙氨酸氨基转移酶)测定;处死大鼠取肝脏和肺,肝脏于4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肝组织的形态学改变,肺组织置于液氮中用于Prx VI m RNA水平、蛋白水平测定以及MDA含量测定。2测定指标及方法2.1 HE染色观察大鼠肝脏形态结构肝组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肝组织形态变化并进行图象分析。2.2血清ALT水平测定未抗凝血经3000rpm离心10min分离血清,血清ALT水平由全自动生化分析仪测定。2.3肺匀浆的制备和MDA含量测定从-70℃冰箱中取出肺组织,按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%肺组织匀浆,肺组织匀浆内MDA含量经南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定2.4大鼠肺组织Prx VI m RNA水平测定用TRIzol法提取肺内总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内对照,进行RT-PCR。分别以Prx VI的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.5大鼠肺组织内Prx VI蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠肺内Prx VI蛋白水平。将大鼠肺组织制成匀浆,离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定.电泳的蛋白上样量为61ug.经过转膜和封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx VI抗体,室温静置过夜。再加入辣根过氧化物酶标记抗兔Ig G抗体.按发光试剂操作说明进行显影,定影,晾干。用凝胶成像系统扫描胶片并分析图像,以条带的积分光密度值表示其蛋白含量结果:1大鼠肝组织的形态学改变光学显微镜下可见Con组大鼠肝细胞排列成条索状,围绕中央静脉成放射状排列,肝索间肝血窦大小均匀,无明显扩张充血。而HIRI组大鼠的肝组织淤血严重,肝血窦明显扩张充血,肝细胞受压萎缩,肝细胞胞浆染色变浅且有空泡出现,部分肝细胞水肿明显,体积增大,染色变浅。2血清ALT水平Con组大鼠血清中ALT为20.03±5.23U/L,而HIRI组血清ALT为87.43±9.06 U/L。HIRI组大鼠血清ALT水平明显高于Con组(P0.01)。3肺匀浆内MDA的含量Con组大鼠肺内MDA的含量为9.81±1.89mmol/g,而HIRI组MDA含量为14.09±2.47 mmol/g。HIRI组大鼠肺内MDA的含量明显高于Con组(P0.01)4肺组织Prx VI m RNA相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠肺组织内抗氧化酶Prx VI m RNA的表达量。计算与内参照的比值得出相对表达量进行结果统计。分析表明:HIRI组大鼠肺组织内的Prx VI m RNA水平均明显高于Con组(P0.01)。说明HIRI组大鼠肺组织内Prx VI表达升高。5大鼠肺组织内Prx VI的蛋白水平HIRI组大鼠肺组织内Prx VI的蛋白表达水平(1.02±0.19)明显高于对照组(0.65±0.13)(P0.01)。结论:1结扎肝左、中血管和胆管蒂可成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。2大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肺组织中MDA含量增加,Prx VI的基因水平、蛋白水平均明显增强,提示:肺组织已遭受过氧化损伤,Prx VI参与了氧化应激反应
【关键词】：肝脏缺血再灌注损伤模型 过氧化酶VI 丙二醛 氧化应激 活性氧族
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-22
• 结果22-23
• 附图23-30
• 附表30-33
• 讨论33-34
• 结论34
• 参考文献34-37
• 综述 肝脏缺血再灌注损伤的氧化还原疗法37-50
• 参考文献43-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【参考文献】

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1 曹建明;张佳雷;牛爱清;秦建斌;;大鼠急性肝缺血-再灌注时心肌细胞氧化损伤及瑞芬太尼的干预作用[J];临床麻醉学杂志;2011年01期

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本文编号：629573