血清类胰岛素生长因子IGF-1和肝组织IGF-1R在肝硬化病理过程中的表达

发布时间：2017-08-08 20:37

  本文关键词：血清类胰岛素生长因子IGF-1和肝组织IGF-1R在肝硬化病理过程中的表达

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【摘要】：研究背景:肝硬化是一种常见的消化系统疾病,常常继发于多种慢性肝脏疾病,以肝小叶结构破坏,残余肝组织结节样增生以及肝纤维组织增生为主要病理学特征。肝硬化严重危害着人类的健康,每年有上百万人死于肝硬化及相关并发症。在西方发达国家,肝硬化的主要病因为丙型病毒性肝炎,酒精性肝炎以及非酒精性脂肪肝,而在亚撒哈拉以及亚洲大部分地区乙型病毒性肝炎则是肝硬化的主要病因。大量证据表明,肝硬化能够增加肝细胞癌的发病风险,是肝癌发生的独立危险因素,然而肝硬化向肝癌转变的具体机制尚不十分明确。类胰岛素生长因子I(IGF-1)是一种体内重要的生长刺激因子,能够通过自分泌、旁分泌以及内分泌等途径作用于其受体,促进组织和器官的生长及发育。正常生理情况下,体内超过90%的IGF-1均是由肝组织合成和分泌的,虽然身体很多其他器官也能够合成,但只占很小的比例。研究表明IGF-1能够促进包括肝癌的多种癌症细胞的增值,此外IGF-1的主要受体类胰岛素生长因子受体I(IGF-1R)在包括肝癌的多种肿瘤组织中表达上调,并于肿瘤的侵袭性、转移性、对放化疗的敏感性以及患者的预后密切相关。虽然已经证实IGF-1/IGF-1R对肝癌的发生发展有着较为明确的促进作用,但是IGF-1/IGF-1R在肝硬化病理过程中的变化及与肝癌发生的关系却尚不十分明确,有文献报道肝硬化患者血清IGF-1浓度较正常人有所降低,这似乎与IGF-1对肿瘤发生发展的促进作用相矛盾。本实验主要通过实验证实肝硬化时血清IGF-1与肝组织IGF-1R表达的变化,并进一步探讨引起二者变化的内在调控机制,为解释肝硬化向肝癌转变的具体机制提供进一步的理论支持。1.肝硬化对血清IGF-1的影响及引起变化的可能原因建立四氯化碳小鼠肝硬化模型,整个造模周期共12周。收集临床肝硬化患者与非肝硬化患者血清标本。应用试剂盒法检测小鼠血清转氨酶ALT和AST的变化;对小鼠肝组织石蜡切片进行HE染色和Masson染色检验肝硬化小鼠造模是否成功;应用ELISA(Enzyme linked Immunosorbent Assay)试剂盒检测小鼠及患者血清IGF-1浓度的变化;测量小鼠肝重和体重,计算并比较各组实验小鼠肝指数及脾指数。实验结果表明四氯化碳肝硬化小鼠模型第1周和第4周主要表现为急性肝损伤,表现为肝组织局灶性坏死及肝细胞的空泡样变性,血清转氨酶AST及ALT明显升高。第8周时纤维组织明显增生,组织病理学表现出部分肝硬化的特征,出现明显的肝纤维组织增生形成的条索。第12周肝硬化模型建立成功,肝脏大体标本可见突出肝表面的结节,纤维组织进一步增生,整个造模过程中血清转氨酶AST与AST均有明显的升高。ELISA检测小鼠血清IGF-1提示造模组第12周血清IGF-1明显降低,ELISA法检测临床患者血清IGF-1提示肝硬化患者血清IGF-1明显低于对照组,证明肝硬化能够引起血清IGF-1浓度的降低。通过对比第8周及第12周造模组小鼠肝指数发现,第12周小鼠肝指数明显降低,说明肝实质发生萎缩。以上结果推测肝硬化时血清IGF-1浓度的降低主要可能是由肝实质的萎缩引起肝脏合成功能的下降引起。2.肝硬化时肝组织IGF-1R表达水平的变化及其引起变化的可能原因收集上述实验小鼠肝组织标本以及临床肝硬化患者与非肝硬化患者肝组织石蜡切片。对实验小鼠及临床患者肝组织石蜡切片进行IGF-1R的免疫组织化学染色;以GAPDH为内参应用Western-blot法检测小鼠肝组织IGF-1R蛋白的表达;以GAPDH为内参应用Western-blot法检测IRS-1,AKT蛋白和GSK-3β,FOXO3a蛋白以及相应磷酸化形式蛋白表达水平并进行分析。小鼠肝组织石蜡切片免疫组织化学染色以及小鼠肝组织IGF-1R的Western-blot检测提示第12周造模组小鼠肝组织IGF-1R表达明显上调,临床患者肝组织石蜡切片提示肝硬化患者肝组织IGF-1R的表达明显高于非肝硬化患者。小鼠肝组织Western-blot结果提示造模组第12周小鼠肝组织p-IRS-1和p-AKT表达水平下降,证明IRS-1和AKT蛋白激活程度降低;另一方面,p-GSK-3β和p-FOXO3a表达水平降低,p-GSK-3β/GSK-3β和p-FOXO3a/FOXO3a比值均下降,证明GSK-3β和FOXO3a蛋白激活程度提高。同时FOXO3a/GAPDH的比值升高,证明FOXO3a表达上调。已有文献报道证实FOXO3a能够与IGF-1R蛋白基因的启动子结合,促进IGF-1R基因的转录,最终引起IGF-1R表达的上调。结论:肝硬化时血清IGF-1降低,其原因在于肝硬化病理改变引起肝实质发生萎缩,引起肝脏合成功能降低。血清IGF-1降低使得IGF-1R下游通路蛋白IRS-1和AKT的激活程度减低,使AKT对GSK-3β和FOXO3a蛋白的抑制作用有所缓解,GSK-3β和FOXO3a蛋白得以激活。GSK-3β能够促进FOXO3a蛋白的表达,而FOXO3a能够和IGF-1R基因的启动子结合,从而促进IGF-1R基因的转录,最终引起肝组织IGF-1R表达的上调。
【关键词】：肝硬化 肝脏 IGF-1 IGF-1R AKT GSK-3β FOXO3a
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 提要4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 英文缩略词表14-16
• 前言16-18
• 第1章 文献综述18-34
• 1.1 IGF系统与肝硬化及肝癌18-26
• 1.1.1 IGF系统简介18-21
• 1.1.2 IGF系统与肝硬化21-24
• 1.1.3 IGF系统与肝细胞肝癌24-26
• 1.2 GSK-3 的研究进展26-30
• 1.2.1 GSK-3 简介26-27
• 1.2.2 GSK-3 相关信号通路27
• 1.2.3 GSK-3 与疾病27-30
• 1.3 FOXO3a的研究进展30-34
• 1.3.1 FOXO蛋白家族简介30-31
• 1.3.2 FOXO3a的研究进展及临床意义31-34
• 第2章 材料与方法34-50
• 2.1 实验材料34-37
• 2.1.1 血清标本34
• 2.1.2 实验动物34
• 2.1.3 实验试剂及试剂盒34-35
• 2.1.4 主要抗体35-36
• 2.1.5 实验仪器36-37
• 2.2 实验方法37-50
• 2.2.1 主要溶液配制37-40
• 2.2.2 小鼠的饲养40
• 2.2.3 实验小鼠的分组40-41
• 2.2.4 小鼠肝纤维化模型的建立41-42
• 2.2.5 小鼠挖眼取血法及组织标本的采集及保存42
• 2.2.6 小鼠血清转氨酶活力的测定42-43
• 2.2.7 小鼠肝组织IGF-1R的免疫组织化学染色43-44
• 2.2.8 小鼠肝组织H&E染色44-45
• 2.2.9 小鼠肝组织Masson染色 （Masson染色试剂盒法）45
• 2.2.10 血清IGF-1 的ELISA测定 （试剂盒法）45-46
• 2.2.11 肝组织总蛋白的提取46-47
• 2.2.12 提取样品中蛋白质的定量（BCA法）47-48
• 2.2.13 蛋白上样液的制备48
• 2.2.14 蛋白质免疫印迹试验（Western-blot）48-49
• 2.2.15 统计学分析49-50
• 第3章 实验结果及讨论50-74
• 实验一：肝硬化时血清IGF-1 的变化及引起变化的可能原因50-64
• 3.1.1 实验结果50-59
• 3.1.2 讨论59-63
• 3.1.3 结论63
• 3.1.4 创新点63-64
• 实验二： 肝硬化时肝组织IGF-1R表达水平的变化及其相关调控机制64-74
• 3.2.1 实验结果64-70
• 3.2.2 讨论70-73
• 3.2.3 结论73
• 3.2.4 创新点73-74
• 参考文献74-87
• 作者简介及其在学期间所取得的科研成果87-88
• 致谢88

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本文编号：641960