A20在幽门螺杆菌相关性胃炎中的作用机制研究

发布时间：2017-08-09 22:29

  本文关键词：A20在幽门螺杆菌相关性胃炎中的作用机制研究

  更多相关文章： 幽门螺杆菌 A20 miR-29a-3p NF-κB信号通路

【摘要】：目的:本研究旨在检测H.pylori感染组织及细胞中A20及mi R-29a-3p的表达差异,明确在H.pylori感染中H.pylori、mi R-29a-3p、A20三者间的作用关系,探索A20在H.pylori感染相关性胃炎发生发展中的作用机制,有望为临床H.pylori感染相关性胃炎的分子诊断及靶向治疗提供新的依据和思路。方法:采用IHC及qRT-PCR的方法检测H.pylori感染胃黏膜组织中A20、mi R-29a-3p的表达,Western blot及q RT-PCR分析H.pylori感染细胞模型中A20、mi R-29a-3p的表达。运用生物信息学软件预测mi R-29a-3p的靶基因,通过Luciferase和Western blot验证mi R-29a-3p的靶基因。mi R-29a-3p mimics转染细胞后再感染H.pylori,Western blot分析H.pylori、A20、mi R-29a-3p三者间的作用关系。采用基因干扰、过表达技术分别沉默和过表达A20,Western blot检测phosphorylated NF-κB p65及NF-κB p65的表达,免疫荧光分析NF-κB p65核转位,q RT-PCR和ELISA分析NF-κB下游炎症因子IL-6和IL-8的表达。同时将基因干扰和H.pylori感染相结合,初步探索A20在H.pylori感染相关性胃炎中的作用机制。结果:相对于H.pylori感染阴性的正常胃黏膜或轻度胃炎组织,A20在H.pylori感染阳性的胃炎或溃疡组织中表达显著降低,体外H.pylori感染细胞模型中显示了一致的结果,并且A20表达降低具有H.pylori感染时间和浓度依赖性。而mi R-29a-3p在H.pylori感染阳性的胃炎或溃疡组织中表达上调,在体外H.pylori感染细胞模型中mi R-29a-3p表达也增加且具有H.pylori感染浓度依赖性。A20被预测验证为mi R-29a-3p的靶基因,在H.pylori感染中H.pylori通过上调mi R-29a-3p表达进而使A20表达水平降低。过表达A20能增强phosphorylated NF-κB p65的表达及NF-κB p65核转位,同时增加NF-κB下游炎症因子IL-6和IL-8的表达,而沉默A20表达后,则能相应地抑制NF-κB p65的活化及其下游炎症因子的表达。相对于H.pylori感染组,IL-6和IL-8在A20沉默后再感染H.pylori组中的表达水平降低,表明沉默A20能抑制H.pylori感染所诱导的炎症反应。结论:A20在H.pylori感染组织及细胞中表达降低,而mi R-29a-3p在H.pylori感染组织及细胞中表达增加,A20是mi R-29a-3p的直接靶基因,在H.pylori感染中H.pylori通过上调mi R-29a-3p表达进而使A20表达水平降低。A20表达降低能抑制NF-κB活化及其下游炎症因子的表达,提示A20表达下调可能在H.pylori感染中起到保护机体免受损伤的作用。
【关键词】：幽门螺杆菌 A20 miR-29a-3p NF-κB信号通路
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R573.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩略词中英注释表13-15
• 第一章 绪论15-23
• 1.1 H.pylori简述15
• 1.2 参与H.pylori相关性胃炎发生的主要毒力因子15-17
• 1.3 参与H.pylori相关性胃炎发生的差异表达基因17-19
• 1.3.1 异常表达的miRNAs与H.pylori相关性胃炎发生的关系17
• 1.3.2 异常表达的Lnc RNAs与H.pylori相关性胃炎发生的关系17-19
• 1.4 炎症相关蛋白A20的研究19-23
• 1.4.1 A20的生物学特性19
• 1.4.2 A20在组织中的表达19-20
• 1.4.3 A20与疾病的关系20-21
• 1.4.4 A20与病原微生物21-23
• 第二章 研究目的、方法、技术路线及意义23-26
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 技术路线24-25
• 2.3.1 H.pylori感染组织及细胞中A20、miR-29a-3p的表达分析24
• 2.3.2 H.pylori、miR-29a-3p、A20三者间调控关系的研究24-25
• 2.3.3 A20通过NF-κB参与H.pylori诱导的炎症反应25
• 2.4 研究意义25-26
• 第三章 H.pylori感染组织及细胞中A20、mi R-29a-3p表达分析26-41
• 3.1 材料26-30
• 3.1.1 组织标本采集26-27
• 3.1.2 细胞和菌株27
• 3.1.3 主要试剂27-28
• 3.1.4 主要溶液配制28-29
• 3.1.5 主要仪器及耗材29-30
• 3.2 方法30-34
• 3.2.1 细胞培养30-31
• 3.2.2 细菌培养31
• 3.2.3 细胞与H.pylori 26695共培养31
• 3.2.4 免疫组织化学31-32
• 3.2.5 Western blot32
• 3.2.6 组织和细胞总RNA提取32-33
• 3.2.7 miRNA逆转录33
• 3.2.8 miRNA定量33-34
• 3.2.9 统计学处理34
• 3.3 结果34-38
• 3.3.1 A20在H.pylori感染阳性胃黏膜组织中的表达34-35
• 3.3.2 H.pylori感染细胞模型中A20蛋白表达35-36
• 3.3.3 A20在H.pylori不同感染时间及浓度下的表达分析36
• 3.3.4 细胞及组织标本总RNA完整性及纯度检测36-37
• 3.3.5 H.pylori感染的胃黏膜组织中miR-29a-3p的表达37-38
• 3.3.6 H.pylori感染细胞模型中miR-29a-3p的表达38
• 3.4 讨论38-41
• 第四章 H. pylori感染中H. pylori、miR-29a-3p、A20三者间作用关系验证41-55
• 4.1 材料41-43
• 4.1.1 菌株、细胞和质粒41-42
• 4.1.2 主要试剂42
• 4.1.3 主要溶液配制42-43
• 4.1.4 主要仪器43
• 4.2 方法43-49
• 4.2.1 miR-29a-3p靶基因预测43
• 4.2.2 寡核苷酸片段设计43-44
• 4.2.3 互补寡核苷酸退火44
• 4.2.4 空psiCHECK-2 载体双酶切44-45
• 4.2.5 psiCHECK-2 双酶切产物胶回收45
• 4.2.6 T-4 连接反应45
• 4.2.7 感受态细胞制备45-46
• 4.2.8 连接产物转化DH5α感受态细胞46
• 4.2.9 重组质粒鉴定46
• 4.2.10 质粒提取46-47
• 4.2.11 质粒与miRNA共转染47-48
• 4.2.12 荧光素酶活性检测48
• 4.2.13 miRNA（mimics/inhibitors）转染48
• 4.2.14 统计学处理48-49
• 4.3 结果49-52
• 4.3.1 miR-29a-3p与A20 mRNA3'UTR结合位点预测49
• 4.3.2 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定49-50
• 4.3.3 miR-29a-3p与A20 mRNA3'UTR结合位点的验证50-51
• 4.3.4 miR-29a-3p在转录后水平抑制A20蛋白表达的验证51-52
• 4.3.5 在H.pylori感染中H.pylori、miR-29a-3p、A20三者间作用关系的验证52
• 4.4 讨论52-55
• 第五章 初步探索A20在H.pylori诱导的胃相关性炎症中的作用机制55-66
• 5.1 材料55-56
• 5.1.1 细胞及质粒55
• 5.1.2 主要试剂55-56
• 5.1.3 主要仪器及耗材56
• 5.2 方法56-59
• 5.2.1 siRNA瞬时转染56-57
• 5.2.2 质粒转染57
• 5.2.3 mRNA逆转录57-58
• 5.2.4 荧光定量PCR58-59
• 5.2.5 免疫荧光59
• 5.2.6 ELISA检测59
• 5.3 结果59-63
• 5.3.1 A20 siRNA干扰效果验证59-60
• 5.3.2 A20对phosphorylated NF-κB p65及NF-κB p65表达的影响60-61
• 5.3.3 A20对NF-κB p65核转位影响61
• 5.3.4 A20对NF-κB p65下游炎症因子IL-6/IL-8 的表达影响61-62
• 5.3.5 A20对H.pylori感染诱导的IL-6/IL-8 表达的影响62-63
• 5.4 讨论63-66
• 第六章 主要结论及展望66-67
• 6.1 主要结论66
• 6.2 主要展望66-67
• 参考文献67-74
• 致谢74

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本文编号：647662