基于高通量测序研究基底硬度与转化生长因子TGF-β1对肝细胞功能的影响

发布时间：2017-08-11 13:01

  本文关键词：基于高通量测序研究基底硬度与转化生长因子TGF-β1对肝细胞功能的影响

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【摘要】：目的:基于高通量测序技术,探究基底硬度的变化与TGF-β1对人正常肝细胞(L02)细胞功能的影响,从而研究肝细胞生物行为与肝纤维化进程的关系,为治疗肝组织病变提供新的视角。方法:以聚乙烯醇水凝胶(PVA)为基底膜,构建与正常肝组织(4.6 kPa)、肝纤维化早期(19 kPa)、肝纤维化中后期(37 kPa)肝脏组织硬度相当的体外培养模型;在不同硬度PVA膜上培养L02细胞,通过流式细胞术检测不同硬度PVA膜上细胞凋亡比率;基于高通量测序技术筛选不同硬度基底与TGF-β1协调作用下的差异表达基因;运用免疫荧光技术检测不同硬度基底膜上TGF-β1组与对照组细胞形态和骨架构象的变化,采用RT-PCR和Western-Blot技术检测E-cadherin、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1的基因及蛋白表达水平。结果:构建了硬度可控(4.6kPa、19kPa、37kPa)的PVA膜的体外培养模型;L02细胞在PVA膜上培养48小时可呈现融合生长,不同硬度PVA膜上细胞的凋亡率均低于10%,且随着硬度的增加,细胞凋亡程度下降,证明PVA水凝胶作为细胞培养基底膜具有优良的生物学相容性,适用于L02细胞的体外培养;细胞球形指数随基底硬度的增加而变大,说明基底硬度增强了细胞的形变能力;测序结果发现,TGF-β1组和对照组在细胞骨架、粘附等相关方面的基因表达差异显著,结合前期研究,筛选出差异基因E-cadherin、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1;免疫荧光实验表明随着基底硬度的增加细胞骨架发育能力增强,且在硬基底上出现明显的纤维束和伪足,在4.6kPa的软基底上,TGF-β1组和对照组的细胞骨架构象并无明显变化,但在19kPa和37k Pa较硬基底上,TGF-β1促进了骨架的发育;基因和蛋白方面的检测结果表示,随着硬度的增加,E-cadherin、beta-Catenin表达量下降,Integrinβ1表达量增加,说明其细胞粘附系统发生了变化,TGF-β1激活整合素系统加剧了这一变化;Collagen-1、Alpha-SMA的表达量在TGF-β1组随着基底硬度的增加而显著增加,表明TGF-β1促进诱导细胞的EMT过程,在肝纤维化胞外基质胶原沉积中发挥着重大作用。结论:本文实验结果显示,基底硬度的改变影响细胞的生物力学特性和生物功能,硬度的增加增强了TGF-β1对细胞表型的转变,从理化协同作用的角度研究肝细胞的功能变化,为肝纤维化的机制研究提供新的视角。
【关键词】：基底硬度 TGF-β1 细胞骨架
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-6
• 英文缩写词表6-10
• 1 绪论10-22
• 1.1 国内外研究现状10-19
• 1.1.1 TGF-β1 对肝纤维化的影响12-16
• 1.1.2 基底硬度对细胞功能的影响16-18
• 1.1.3 高通量测序技术18-19
• 1.2 问题的提出及研究意义19-20
• 1.2.1 问题的提出19-20
• 1.2.2 研究意义20
• 1.2.3 创新点20
• 1.3 研究目的与研究内容20-21
• 1.3.1 研究目的20
• 1.3.2 研究内容20-21
• 1.4 技术路线21-22
• 2 硬度可控的基底膜的制备及检测22-34
• 2.1 引言22-23
• 2.2 实验材料和实验设备23-24
• 2.2.1 主要实验细胞23
• 2.2.2 主要实验试剂23
• 2.2.3 实验设备23-24
• 2.2.4 试剂的配制24
• 2.3 实验方法24-28
• 2.3.1 聚乙烯醇水凝胶基底膜的制备方法24-25
• 2.3.2 聚乙烯醇水凝胶弹性模量的测定25-27
• 2.3.3 扫描电镜观察PVA水凝胶表面形貌27
• 2.3.4 细胞培养27
• 2.3.5 细胞凋亡检测方法27-28
• 2.4 实验结果28-33
• 2.4.1 PVA水凝胶弹性模量的测量结果28-29
• 2.4.2 扫描电镜对聚乙烯醇水凝胶基底膜表面形貌的测定结果29-30
• 2.4.3 细胞凋亡30
• 2.4.4 细胞形态30-33
• 2.5 讨论33-34
• 3 高通量测序及基因的挖掘34-47
• 3.1 引言34
• 3.2 材料与方法34-37
• 3.2.1 测序样品准备及RNA的提取34-35
• 3.2.2 RNA样品质量的检测35
• 3.2.3 文库建立及测序35-37
• 3.2.4 数据过滤处理37
• 3.3 结果与分析37-45
• 3.3.1 RNA-Seq序列数据比对与质控分析37-39
• 3.3.2 RNA-Seq差异基因定量分析39-42
• 3.3.3 RNA-Seq功能注释42-44
• 3.3.4 肝纤维化相关基因挖掘44-45
• 3.4 讨论45-47
• 4 基底硬度和TGF-Β1 对肝细胞功能的影响47-61
• 4.1 引言47-48
• 4.2 实验材料、设备和试剂48-50
• 4.2.1 主要实验材料48-49
• 4.2.2 实验设备49
• 4.2.3 试剂的配制49-50
• 4.3 实验方法50-54
• 4.3.1 免疫荧光50
• 4.3.2 实时荧光定量PCR（RT-PCR）50-51
• 4.3.3 western blot（蛋白免疫印迹）51-54
• 4.4 实验结果及分析54-59
• 4.4.1 基底硬度和TGF-β1 对肝细胞骨架构象的影响54-56
• 4.4.2 基底硬度和TGF-β1 对肝细胞骨架及粘附分子的基因表达水平的测定与分析56-58
• 4.4.3 基底硬度和TGF-β1 对肝细胞骨架及粘附分子的蛋白表达水平的测定与分析58-59
• 4.5 讨论59-61
• 5 结论与展望61-63
• 5.1 主要结论61
• 5.2 后续工作展望61-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：656220