失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用

发布时间：2017-08-14 00:32

  本文关键词：失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用

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【摘要】：第一部分:失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞的分离、培养及其生物学特性的研究目的:建立失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养体系,并探讨其生物学特性。方法:采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合,培养基为含自体血清间充质干细胞培养基,从失代偿性肝硬化患者骨髓中分离培养间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察骨髓MSCs的培养成功率、原代培养时间,测定生长曲线,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度。结果:失代偿性肝硬化患者BMSCs的体外分离培养成功率100%(9/9);BMSCs的原代培养时间为(13.0±2.3)天,传代培养时间(8.4±1.7)天;BMSCs具有相似的形态,均呈梭形,成纤维细胞样细胞,P3代骨髓间充质干细胞的纯度可达95%,其高表达CD44(95.01%)、CD29(92.79%),低表达CD34(1.31%)、CD45(1.08%),符合MSCs的免疫学特征。结论:肝硬化患者来源的MSCs具有MSCs的共同生物学特性,使用自体血清培养基体外培养的肝硬化患者BMSCs生长稳定,增殖旺盛,能连续传代,可能是替代原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)的理想的“种子细胞”。第二部分:失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用目的:探讨失代偿期乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs对自体外周血T淋巴细胞的免疫调节作用。方法:分离失代偿性肝硬化患者外周血淋巴细胞行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA SE)荧光染色,在植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激下,培养基为自体血清,自体外周血淋巴细胞与P3代BMSCs共培养,实验分四组:①BMSCs+淋巴细胞+PHA接触培养组;②BMSCs+淋巴细胞+PHA非接触培养组;③淋巴细胞+PHA阳性对照组;④单独淋巴细胞阴性对照组。流式细胞术检测各组淋巴细胞增殖情况和CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)及CD4+CD8-IL-17+辅助性T细胞17(T helper 17 cell,Th17)细胞频数,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测BMSCs的白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)m RNA表达水平。结果:流式细胞术显示:1.接触培养组及非接触培养组的细胞增殖较阳性对照组明显减低(P0.01),但亦显著高于阴性对照组(P0.01),其组间比较,淋巴细胞增殖无显著差异(P0.05);2.接触培养组及非接触培养组Tregs细胞频率显著高于阳性及阴性对照组(P0.01),但其组间比较Tregs频数无显著差异(P0.05);3.接触培养组及非接触培养组的Th17细胞频率显著高于阴性对照组(P0.01),但低于阳性对照组(P0.01),其组间比较亦无显著差异(P0.05);4.培养前后组内比较:接触培养组及非接触培养组Treg/Th17比率均明显上调(P均0.01),而阳性及阴性对照组变化不明显(P均0.05)。培养后组间比较,接触培养组及非接触培养组Treg/Th17比率显著高于阳性及阴性对照组(P均0.01),其组间比较亦无显著差异(P0.05)。RT-PCR实验结果显示:培养前后组内比较,培养后接触培养组及非接触培养组TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相对水平均显著高于培养前(P均0.01);培养后组间比较,接触培养组及非接触培养组TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相对水平均无显著差异(P0.05)。结论:失代偿期乙型肝炎肝硬化患者的骨髓MSCs可抑制自体淋巴细胞增殖,显著上调Tregs表达,并改善Treg/Th17失衡,其免疫调节机制可能与分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β1有关。
【关键词】：肝硬化 骨髓间充质干细胞 培养 生物学特性 肝硬化 骨髓间充质干细胞 Treg Th17 Treg/Th17 IL-10 TGF-β1
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 第一部分 失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞的分离、培养及其生物学特性的研究12-20
• 一、材料12-13
• 二、方法13-15
• 三、结果15-17
• 四、讨论17-20
• 第二部分 失代偿性肝硬化患者的骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用20-38
• 一、材料20-21
• 二、方法21-26
• 三、结果26-33
• 四、讨论33-38
• 参考文献38-44
• 全文总结44-45
• 综述45-56
• 参考文献51-56
• 英文缩略词表56-57
• 攻读学位期间公开发表的论文57-58
• 致谢58-59

【参考文献】

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本文编号：669878