AAT失代偿在脂肪肝大鼠急性胰腺炎中的作用和机制研究

发布时间：2017-08-13 23:09

  本文关键词：AAT失代偿在脂肪肝大鼠急性胰腺炎中的作用和机制研究

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【摘要】：研究背景急性胰腺炎(AP)是胰腺的一种炎症性疾病,大多数患者病程为自限性,预后良好,但有一部分患者病情较重,常常进展为致命的重症急性胰腺炎(SAP)。SAP的总死亡率接近20%。SAP的危险因素包括酒精、肥胖、阿片类药物以及非酒精性脂肪肝(NAFLD,也被称为肝脂肪变)。NAFLD不是一种特异的疾病,而是一种临床上非常普遍的现象。它以肝细胞的炎症、坏死和凋亡为特征,发病率在全世界人口中高达10-24%。脂肪肝加重胰腺炎的机制至今尚未完全阐明。然而目前有以下几种可能的机制。脂肪肝常常合并高脂血症,而后者可以引起胰腺微循环障碍、氧化应激、游离氧自由基的积聚以及导管坏死。高脂血症还能削弱红细胞的携氧能力,增加血红蛋白的氧亲和力从而导致组织缺氧。而且游离的氧自由基和氧化应激也会促进胰腺炎的进展,甘油三酯的代谢产物也会加剧胰腺导管的损伤。脂肪肝确实能够从许多方面促进胰腺炎的进展。α-1抗胰蛋白酶(AAT)是一种可以穿过组织的水溶性的糖蛋白,超过80%的AAT是由肝细胞合成分泌。此外巨噬细胞和一些肿瘤细胞也能合成。当组织损伤时AAT合成增加,因此它又被称为急性反应期蛋白。除了抑制中性粒细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶外,AAT还抑制cathepsin-G和proteinase-3之类的蛋白水解酶。然而在一些情况下aat的活性是降低的,例如吸烟的有害成分过氧化氢可以使aat失活。aat的缺乏会导致蛋白酶和其抑制剂间的平衡被打破,从而促使copd,肝硬化,肝癌等许多疾病的进展。然而aat在急性胰腺中的作用机制尚未完全阐明。本研究中我们成功建立了脂肪肝胰腺炎大鼠模型(hsap)和非脂肪肝胰腺炎大鼠模型(nhsap),首先我们采用蛋白组学的方法筛选hsap和nhsap血清差异表达蛋白,结果发现aat蛋白在两组间差异表达显著,接着我们又使用临床血清样本进行了验证。为了进一步探索脂肪肝加重胰腺炎的分子机制,我们采用rna-seq高通量测序的方法分析hsap和nhsap组间差异表达基因和相关分子通路,为临床应用奠定基础。研究一目的探索hsap和nhsap间差异表达蛋白方法使用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射的方法建立大鼠急性胰腺炎模型。采用二维凝胶电泳和质谱鉴定的方法筛选脂肪肝胰腺炎大鼠与非脂肪肝胰腺炎大鼠血清中差异表达的蛋白。为了验证蛋白组学的结果,我们用elisa的方法检测了正常饮食组(nd),高脂饮食组(hfd),非脂肪肝胰腺炎组(nhsap组),脂肪肝胰腺炎组(hsap组)4组血清中aat的含量,接着采用westernblot和免疫组化做进一步的验证。结果我们成功建立了hsap与nhsap模型,二维凝胶电泳图显示共有14个表达下调的蛋白,4个表达上调的蛋白,经质谱鉴定aat为两组间差异表达的蛋白之一。elisa结果显示:hsap组血清aat含量与nhsap组相比明显下降,与蛋白组学的结果一致。免疫组化的结果同样显示hsap组aat的表达量与nhsap组相比明显下降。结论综上所述,我们通过动物实验证明了脂肪肝大鼠在发生胰腺炎时血清中aat处于失代偿状态。研究二目的探索肝脂肪变性时aat变化与ap的病程关系方法采用elisa的方法检测健康对照组(nc)、脂肪肝组(fld)、非脂肪肝胰腺炎组(nhsap)和脂肪肝胰腺炎组(hsap)4组血清中aat的含量。将以上4组符合纳入标准的病人静脉采血,室温放置半小时后860g,15min,4℃离心后获得血清,并将其保存于-80℃冰箱。分析hsap组血清aat与apache-ii评分间的关系。结果elisa检测aat在hsap组的水平:1.63±0.34mg/ml(range:0.74-2.59mg/ml);正常组2.54±0.21mg/ml(range:2.16-2.90mg/ml);nhsap组为3.92±0.37mg/ml(range:3.1-4.78mg/ml);fld组为2.30±0.27mg/ml(range:1.81-2.69mg/ml)。apache-ii评分和hsap病人血清aat水平呈负相关(r=-0.85,p0.01)。结论脂肪肝病人在发生胰腺炎后aat的合成处于失代偿状态,脂肪肝导致的aat下调会加重胰腺炎病情。研究三目的利用rna-seq技术比较脂肪肝胰腺炎(apfl)与非脂肪肝胰腺炎(ap)发病机制的异同方法采用高通量测序rna-seq技术分析apfl与ap间差异表达的基因,之后将这些差异基因进行go功能分析和kegg通路富集分析,最后使用rt-pcr验证差异表达基因。结果kegg结果显示pparγ信号通路以及所调节的脂肪酸代谢通路和jak/sata炎症通路参与到apfl和ap的病理过程中,并且在apfl组中的富集程度更为明显。qrt-pcr验证参与到ppar信号通路和脂肪酸代谢通路的部分基因,与rnaseq分析的结果一致。结论脂肪肝可能通过PPARγ通路影响脂肪代谢和炎症反应,进而加重胰腺炎的病情。
【关键词】：α1抗胰蛋白酶 脂肪肝 急性胰腺炎 高通量测序
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-50
• 第一部分 脂肪肝在大鼠急性胰腺炎中降低AAT水平50-63
• 1 材料50-51
• 2.方法51-56
• 3.结果56-60
• 4.讨论60-63
• 第二部分 肝脂肪变性时AAT变化与AP的病程关系63-72
• 1.材料63-65
• 2.方法65-67
• 3.结果67-70
• 4.讨论70-72
• 第三部分 利用RNA-SEQ技术比较APFL与AP发病机制的异同72-99
• 1.材料72-74
• 2.方法74-77
• 3.结果77-95
• 4.讨论95-99
• 小结99-100
• 参考文献100-117
• 个人简历和研究成果117-118
• 致谢118

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本文编号：669483