沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导急性胰腺炎细胞模型的炎症反应及自噬的影响

发布时间：2017-08-19 03:21

  本文关键词：沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导急性胰腺炎细胞模型的炎症反应及自噬的影响

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【摘要】：目的:自噬是生物体进化过程中存在的高度保守的细胞内物质降解过程,细胞通过形成双层膜结构的自噬体吞噬胞内物质后转运至溶酶体中进行降解再利用。自噬在急性胰腺炎发生发展中作用的研究是当前急性胰腺炎基础研究领域的主要热点之一。自噬相关基因Beclin1是自噬起始阶段的重要调控分子,本研究首先采用RNA干扰技术沉默大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的Beclin1基因表达,构建稳定的Beclin1基因沉默的AR42J细胞系。通过原始细胞系与转染后细胞株的对比,我们了解Beclin1基因在AR42J细胞的增殖、凋亡、自噬及糜蛋白酶表达中的作用,并进一步探讨Beclin1基因对雨蛙素诱导的的急性胰腺炎细胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微结构的影响。方法:1.设计并合成3种靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及阴性对照shRNA,分别插入质粒GV112,重组质粒分别命名为p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC。应用lipo3000将重组质粒瞬转入AR42J细胞,应用RT-PCR检测细胞Beclin1 mRNA表达,筛选出沉默效率最高的质粒,在293T细胞内包装成慢病毒(LV-shBeclin1),感染AR42J细胞,应用嘌呤霉素筛选,采用RT-PCR及蛋白质印迹法分别检测病毒感染细胞Beclin1 mRNA和蛋白表达。2.采用CCK8试剂盒测定原始细胞系与转染后细胞株的生长曲线,了解Beclin1基因对AR42J细胞增殖的作用。采用流式细胞技术检测原始细胞系与转染后细胞株的凋亡情况,了解Beclin1基因对AR42J细胞凋亡的影响。采用透射电镜观察两组细胞的超微结构,了解Beclin1基因对AR42J细胞中自噬影响。采用免疫荧光技术观察两组细胞糜蛋白酶的表达情况,了解Beclin1基因对AR42J细胞中糜蛋白酶表达的影响。3.采用酶联免疫吸附实验检测雨蛙素诱导的的急性胰腺炎细胞模型不同时间点(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h、36h及48h)上清液中的炎性因子水平,及沉默Beclin1基因后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的改变,从而探讨沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导的的急性胰腺炎细胞模型中炎性因子水平的影响。采用蛋白质印迹法检测雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中不同时间点(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h及36h)的凋亡相关蛋白BCL2及自噬相关蛋白LC3表达水平,及沉默Beclin1基因后BCL2及LC3蛋白水平的改变,从而探讨沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导的的急性胰腺炎细胞模型中凋亡及自噬的影响。采用透射电镜技术观察以1×10~(-8)mol/L浓度的雨蛙素作用4h后的两组细胞中自噬水平及炎症程度,从而探讨沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导的的急性胰腺炎细胞模型超微结构的影响。结果:1.重组质粒经琼脂糖凝胶电泳分离及测序证实shRNA序列符合预期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC转染后AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率分别为(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)%。3个p-sh-Beclin1转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞的差异有统计学意义(P值均0.05),而转染p-shRNA-NC细胞的表达抑制率与未转染细胞的差异无统计学意义。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3经慢病毒包装,感染AR42J细胞,应用嘌呤霉素筛选,LV-shBeclin1感染细胞的Beclin1 mRNA表达抑制率为(86.1±1.2)%,蛋白表达抑制率为(87.9±2.8)%,均与未感染细胞无表达抑制的差异有统计学意义(P值均0.01)。2.沉默Beclin1基因对AR42J细胞增殖的影响并无统计学意义(P0.05),但可以促进细胞的凋亡。沉默Beclin1基因使得AR42J细胞中自噬泡数目减少,但并不影响细胞糜蛋白酶的表达。3.酶联免疫吸附实验提示急性胰腺炎初期炎性因子水平逐步上升,6~8h时达最高峰后炎性因子水平逐渐下降后再次升高,36~48h时达到第二次高峰。沉默Beclin1基因后,相应时间点的IL-1β水平下降、IL-6水平多数无明显改变、TNF-α水平多数呈上升趋势。蛋白质印迹法提示沉默Beclin1基因使得雨蛙素诱导的急性胰腺炎中不同时间点的BCL2多数下降,而LC3蛋白多数升高。以1×10~(-8)mol/L浓度的雨蛙素作用4h后,AR42J细胞中出现急性胰腺炎现象,而转染后细胞株中自噬泡明显减少,且并未观察到炎症改变。结论:成功建立Beclin1基因沉默的AR42J细胞株。Beclin1基因参与自噬体的形成,且可以抑制AR42J细胞的凋亡,它对细胞增殖和糜蛋白酶表达并无明显影响。雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中炎性因子水平随时间变化,呈先升后降再升的模式改变。沉默Beclin1基因影响急性胰腺炎中炎性因子水平,及凋亡自噬的程度,且它对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型有明显的保护作用。同时本实验建立的新型细胞株为探讨Beclin1基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供新的细胞模型。
【关键词】：Beclin1 iRNA 自噬 急性胰腺炎 AR42J
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 中英文缩略语表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立13-21
• 一、材料与方法13-17
• 二、实验结果17-19
• 三、讨论19-21
• 第二部分 稳定沉默Beclin1基因对胰腺腺泡细胞的增殖、凋亡、自噬及糜蛋白酶表达的影响21-28
• 一、材料与方法21-23
• 二、实验结果23-26
• 三、讨论26-28
• 第三部分 稳定沉默Beclin1基因对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微结构的影响28-37
• 一、材料与方法28-30
• 二、实验结果30-35
• 三、讨论35-37
• 全文总结37-38
• 全文参考文献38-40
• 综述40-46
• 参考文献43-46
• 在读期间发表论文、著作及获奖情况46
• 参与科研项目46-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：698383