真皮来源间充质细胞移植促进小鼠肝损伤修复的实验研究

发布时间：2017-08-20 23:16

  本文关键词：真皮来源间充质细胞移植促进小鼠肝损伤修复的实验研究

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【摘要】：研究背景肝脏是具有高度再生能力且能对外界损伤发挥生物学防御功能的重要器官。然而当外界损伤程度加剧继而导致肝脏发生功能障碍时,肝脏固有再生潜能将会被抑制,从而导致包括肝功能衰竭在内的严重后果。目前,终末期肝病患者的死亡率高。对于多数严重的肝脏疾病来说,仍然没有十分有效的治疗手段。虽然肝移植是终末期肝病患者的主要治疗手段,其4年存活率≥70%,但由于其供体器官来源相对紧缺、移植费用相对昂贵以及存在较高移植物排斥反应等因素而限制了其进一步在肝脏疾病治疗领域的广泛应用。间充质干细胞/基质细胞(MSCs)具有分化及转分化为多种类型细胞、刺激机体再生和修复损伤组织/器官的能力,以MSCs为主的细胞治疗近年来已在不同脏器的再生医学相关领域广泛地开展研究。研究人员已经发现骨髓来源的间充质干细胞移植能有效的缓解实验性肝衰竭并促进肝脏再生。这被认为是可替代肝移植治疗肝脏疾病的潜在有效方法。已有I期临床试验表明移植骨髓来源的MSCs可以改善肝硬化患者的肝功能。相比于MSCs,不同组织特异性的间充质细胞同样具有再生和免疫调节功能,可被应用于细胞治疗领域。由表皮、真皮及其附属器组成的皮肤被认为是包括人类在内的哺乳动物的最大器官。既往研究表明皮肤真皮层内存在着丰富的MSC样细胞群。由于真皮分布广泛且容易获得,这些真皮来源的细胞被认为是各种疾病进行自体细胞治疗的潜在来源。我们前期的研究已经表明移植皮肤来源的间充质细胞(DMCs)可促进复合放射性损伤大鼠的存活和创面愈合。我们最近的研究表明DMCs移植可降低急性GVHD的发病率和病情严重程度,也可促进脓毒症小鼠的存活。许多研究表明来源于皮肤真皮层的成纤维细胞可以被诱导分化为具有肝细胞特性和功能的细胞。然而,有关DMCs能否直接促进肝损伤修复及DMCs对于不同类型肝损伤是否有治疗潜能的问题都需进一步研究探讨。因而,本课题主要采用两个肝损伤动物模型,对DMCs移植肝损伤的治疗作用进行研究。研究方法1.DMCs移植对CCL4诱导小鼠肝纤维化修复作用的研究1.1dmcs移植对ccl4诱导的小鼠肝纤维化水平的影响通过天狼星红染色、collageni抗体免疫组化染色和肝组织羟脯氨酸含量测定等方法评价了dmcs移植对ccl4诱导的小鼠肝纤维化水平的影响;1.2dmcs移植对ccl4诱导肝纤维化小鼠肝功能的影响通过受试小鼠血清肝功能检测、小鼠肝组织切片的ki67、pck抗体免疫组化染色及肝组织切片tunel染色来评价了dmcs移植对ccl4诱导肝纤维化小鼠肝功能和肝组织再生的影响;1.3dmcs移植改善小鼠肝纤维化的机制研究通过westernblot和免疫组化实验研究了dmcs移植对纤维化肝组织中自噬相关蛋白的表达水平和肝纤维化关键分子tgf-β表达的影响。体外dmcs与巨噬细胞共培养试验中研究了dmcs对炎症关键细胞巨噬细胞功能的影响。2.dmcs移植对放射损伤小鼠肝内的定植情况及其对急性肝损伤修复的研究2.1dmcs移植对放射损伤小鼠的存活影响及dmcs在小鼠各脏器的定植情况观察了dmcs移植对8gy致死剂量放射损伤小鼠的存活有无促进作用,并通过gfp抗体免疫组化染色试验研究了dmcs在急性放射损伤小鼠各个脏器的定植情况;2.2dmcs移植放射损伤对小鼠肝功能的影响通过受试小鼠血清肝功能检测、血清crp的elisa检测和小鼠肝组织切片he染色来评价了dmcs移植对急性放射损伤小鼠肝脏功能的影响;2.3定植于放射小鼠肝内真皮来源的细胞的特征研究通过免疫荧光双标染色研究了定植于放射损伤小鼠肝脏内dmcs的表型,并进一步探索了其生物学特性;通过基因芯片分析了diecs、dmcs和bmmφ三者之间差异基因的表达情况。研究结果1.dmcs移植对ccl4诱导小鼠肝纤维化修复作用的研究1.1小鼠肝组织切片的天狼星红染色、collageni抗体免疫组化染色以及肝组织羟脯氨酸含量测定试验表明dmcs门静脉移植能够显著改善ccl4诱导的小鼠肝纤维化水平;gfp抗体免疫组化染色结果表明dmcs在肝纤维化小鼠的肝内发生短暂定植而不是长期定植;1.2受试小鼠血清肝功能检测、小鼠肝组织切片的ki67、pck抗体免疫组化染色及肝组织切片tunel染色试验表明dmcs移植能够改善小鼠肝功能和促进小鼠肝组织再生、减缓肝内细胞发生凋亡;1.3westernblot和tgf-β抗体免疫组化染色结果表明dmcs移植可以通过促进肝纤维化小鼠肝组织高表达自噬相关蛋白lc3b和低表达p62并抑制了肝内诱导纤维化发生发展的关键分子tgf-β的表达,进而来改善受试小鼠肝纤维化水平;1.4dmcs与巨噬细胞体外共培养实验表明dmcs能够抑制经lps刺激巨噬细胞raw264.7分泌促炎因子il-1β、il-6和促进其分泌抗炎因子il-10,抑制经lps刺激raw264.7和腹腔巨噬细胞的凋亡,促进raw264.7和腹腔巨噬细胞的体外迁移,促进raw264.7和腹腔巨噬细胞的吞噬能力。同时dmcs腹腔移植clp小鼠试验也表明dmcs可促进clp小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。2.dmcs移植对放射损伤小鼠肝内的定植情况及其对急性肝损伤修复的研究2.1dmcs移植能够促进8gy致死剂量放射小鼠的存活;gfp抗体免疫组化染色试验表明移植的dmcs能够选择性地长期定植于放射损伤小鼠的肝内,受试小鼠血清肝功能检测、血清crp的elisa检测和小鼠肝组织切片he染色试验表明dmcs移植具有一定的抗炎保护效应,能够改善放射损伤小鼠肝功能,减缓放射损伤引起的肝细胞脂肪变性,即dmcs移植促进了放射损伤小鼠肝组织的损伤修复;2.2通过免疫荧光双标染色结果表明长期定植于放射损伤小鼠肝的dmcs呈vimentin+、cd45+和f4/80+,在体荧光微球吞噬试验表明定植于放射损伤小鼠肝的dmcs具有吞噬功能,进而提示该群细胞具有巨噬细胞样表型;2.3ki67gfp免疫双标染色试验表明定植于放射损伤小鼠肝的dmcs的这群细胞具有增殖特性,对其进行体外培养也表明该群细胞增殖旺盛,进而表明定植于放射损伤小鼠肝内的dmcs在体内及体外条件下均展现出稳定增殖潜能;2.4定植于放射损伤小鼠肝内的那群真皮间充质来源的巨噬细胞样细胞与bmmφ及raw264.7有着不同的性状:具有巨噬细胞特性并能够参与全身放射所引起的肝损伤修复;获得diecs、dmcs和bmmφ三种细胞差异基因表达谱结论本课题采用小鼠慢性肝损伤和小鼠急性肝损伤这两种动物模型以研究dmcs移植对肝损伤的潜在治疗作用。首先,我们采用ccl4诱导小鼠肝纤维化模型来研究dmcs移植对小鼠慢性肝损伤修复的作用。而后,我们采用8gy致死剂量照射小鼠所致急性放射性肝损伤模型研究dmcs移植对小鼠急性肝损伤修复的作用。本课题的主要结果包括:1.dmcs移植治疗ccl4诱导的肝纤维化模型中dmcs通过旁分泌及营养支持、抑制tgf-β信号通路、抗炎及免疫调节等机制同时影响肝纤维化发生发展过程中的多个环节因素,显著改善了小鼠肝纤维化和促进小鼠肝组织再生;2.DMCs移植治疗致死剂量照射小鼠所致急性肝损伤模型中,DMCs移植能够促进致死剂量照射小鼠的存活,且能够选择性长期定植于小鼠肝内并促进该急性放射性肝损伤的修复,并获得了DIECs、DMCs和BMMφ三种细胞的差异基因表达谱,为后续进一步研究打下基础;3.DMCs移植治疗两种不同类型肝损伤,由于两种肝损伤的受损组织区域微环境的不同,DMCs发挥治疗效应的机制有所不同,因此在进行细胞治疗研究时需要考虑到因组织损伤不同而导致的微环境的差异这一因素,以便选择更为合适的细胞来治疗类型更为合适的组织损伤。
【关键词】：真皮来源间充质细胞 肝损伤 细胞治疗 肝纤维化 辐射
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 真皮来源间充质细胞促进小鼠肝纤维化修复的研究17-44
• 2.1 材料与方法17-26
• 2.2 结果26-40
• 2.3 讨论40-42
• 2.4 小结42-44
• 第三章 真皮来源间充质细胞在放射损伤小鼠肝内的长期定植及其对急性肝损伤修复的作用44-82
• 3.1 材料与方法44-56
• 3.2 结果56-78
• 3.3 讨论78-80
• 3.4 小结80-82
• 全文结论82-83
• 参考文献83-92
• 文献综述一 肝损伤细胞治疗的研究进展92-109
• 参考文献99-109
• 文献综述二 CCL4诱导小鼠肝损伤中细胞治疗对其肝功能AST、ALT影响的系统回顾和meta分析109-129
• 参考文献125-129
• 研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况129-130
• 致谢130

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