NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer细胞活化中的作用和机制以及黄连素对其影响

发布时间：2017-08-21 12:18

  本文关键词：NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer细胞活化中的作用和机制以及黄连素对其影响

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【摘要】：库普弗细胞(kupffer cell, KC)活化在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的发生和发展中起着十分重要的作用。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattty liver disease, NAFLD)整个疾病进程中(NAFL-NASH-肝纤维化)均可见肝小叶内中性粒细胞(neutroph il,也称多形核白细胞,polymorphonuclear leukocyte,PMN)浸润。本研究首先明确了PMNs在NASH早期炎症启动中的作用及其对kupffer细胞的活化作用；其次通过临床研究发现PMNs通过其分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在NASH炎症中的重要作用,且升高的NE及其内源性抑制剂a1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, A1AT的降低可以作为NASH的预测因子；然后以NE抑制剂Sivelestat对NASH炎症和kupffer细胞活化进行了干预研究,并在体外直接证明了NE活化kupffer细胞的TLR4依赖机制；最后以黄连素(berberine, BBR)在NASH小鼠模型进行干预,发现通过降低NE活性并减少kupffer细胞活化可能是BBR治疗NASH的重要机制。第一部分NE在NASH kupffer细胞活化中的作用和机制研究实验一PMNs介导早期kupffer细胞活化的研究目的明确中性粒细胞在NASH早期炎症启动中的作用及其在kupffer细胞活化中的作用。方法C57BL/6J小鼠分别以正常饮食(standard chow,SC)和蛋氨酸胆碱缺乏(methionine/choline-defecient, MCD)饮食喂养1,2,4,8周。中性粒细胞特异性抗体(Anti-Ly6G)用来耗竭小鼠外周血中性粒细胞。CD68, F4/80免疫组化染色以及荧光定量RT-PCR用来检测kupffer细胞活化。结果在炎症早期(1-2周),注射Ab-Ly6G小鼠血清ALT水平显著低于注射IgG的对照组,肝脏脂肪变与炎症也明显减轻,但在炎症后期(第4、8周)耗竭外周血中性粒细胞不能明显减轻NASH小鼠的炎症。CD68, F4/80免疫组化染色以及荧光定量RT-PCR提示注射Ab-Ly6G能够延缓kupffer细胞的活化。结论中性粒细胞在NASH早期炎症启动和kupffer细胞活化中具有重要作用。实验二NE在NASH发生和发展中的作用(临床研究)目的观察NE及其内源性抑制剂AIAT在NASH组织学炎症进展中作用以及NE,A1AT对NASH的预测作用。方法共纳入研究对象252例(NALFD组,n=202；健康对照组,n=50)。所有研究对象均进行了临床生化指标,NE和A1AT的浓度检测。NAFLD组中有86例患者进行了肝穿,并进行了组织学炎症评分和纤维化程度分级。ROC曲线下面积用于评价NE-A1AT对NASH的预测作用。结果NAFLD患者血清NE浓度升高,A1AT浓度降低,导致NE/A1AT比值失调。NE浓度升高在单纯性脂肪肝阶段即开始出现,A1AT降低则从可疑NASH阶段开始,NASH患者则N E/AiAT比值升高。当NAFLD进展到进展期纤维化阶段,升高的NE/A1AT比值开始回复正常。A1AT预测N ASH的敏感性为83.8%,特异性为83.3%,cut-off值为-1459.43；NE/A1AT预测NASH的敏感性为88.8%,特异性为83.3%,cut-off值为0.363。结论血清NE/A1AT比值升高与NASH炎症程度密切相关,并能作为预测NASH的重要血清学标志。实验三NE抑制剂Sivelestat对NASH的防治作用和kupffer细胞活化的干预作用目的明确NE抑制剂Sivelestat对NASH的防治作用及可能机制。方法4周龄C57BL/6J ApoE-/雄性小鼠40只分为：(1)正常饮食SC+生理盐水组,(2)SC+Sivelestat组,(3)高脂高胆固醇饮食(High-fat high-cholesterol, HFHC)+生理盐水组,(4)HFHC+ Sivelestat组。连续喂养12周后取血和肝脏检测血清生化指标,肝组织油红0染色评价脂肪变程度,HE染色进行NAFLD活动度评分(NAFLD activity score, NAS)评价炎症反应。荧定量RT-PCR以及免疫组化检测肝脏炎症因子以及CD68水平。结果HFHC饮食12周能诱导ApoE-/-小鼠出现典型NASH表现。Sivelestat干预组空腹血糖(FPG)、血胆固醇(TC)和肝功能较模型组明显降低,胰岛素敏感性增加,NAS积分降低(5.71±1.11 vs3.16±1.16,P0.05),肿瘤坏死因子(TNF-a)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)也降低。Sivelestat干预后CD68和F4/80的mRNA水平明显降低,免疫组化显示CD68在肝脏内表达减少。结论NE抑制剂Sivelestat对NASH的防治作用明确,减少kupffer细胞活化可能是其防治NASH的重要机制。实验四重组NE (recombinant NE, rNE)活化kupffer细胞的体外研究目的体外进一步明确NE对kupffer细胞的活化作用及其TLR4依赖机制方法分离TLR4野生型(TLR4 wild-type, TLR4-WT)和TLR4突变(TLR4-mutant, TLR4mut)小鼠kupffer细胞进行培养3天。收细胞前6小时予100nM rNE蛋白进行刺激,以加热失活的NE作为对照。提取RNA后,荧光定量RT-PC R测定炎症细胞因子MCP-1,TNF-α, IL-1β等。结果TLR4-WT的kupffer以rNE刺激后炎症因子MCP-1, TNF-α以及IL-1β的mRNA水平明显升高。TLR4mut小鼠的kupffer细胞经同样剂量的rNE刺激后则没有出现相应炎症因子的变化。结论rNE依赖于TLR4体外活化kupffer细胞。第二部分黄连素对N ASH小鼠模型NE介导Kupffer活化的影响研究目的明确BBR对NASH的干预作用及其对NE介导kupffer细胞活化机制的调控。方法8周龄C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠分为SC组、HFHC组以及BBR干预组。干预组6周起予以200mg/kg的BBR灌胃,12周处死所有小鼠。称体重、肝湿重、检测血糖、血脂、肝功能。油红O染色评价脂肪变,HE染色进行炎症评分。酶联免疫反应(ELISA)检测肝组织中NE浓度、蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)方法检测NE水平,荧光发光法检测肝组织中NE活性。荧定量RT-PCR以及免疫组化检测肝脏炎症因子以及CD68和F4/80的水平。结果与SC组相比,模型组小鼠ALT、AST均明显升高(P0.05),TG明显高于对照组(P0.01)。小鼠体重、肝湿重增加,油红O染色面积、密度增加,HE染色可见明显脂肪变及炎症灶,伴明显气球样变,NAS积分达到NASH诊断标准(NAS5)。BBR干预组较HFHC组血清ALT、AST、TC水平较模型组明显降低(P0.05),且油红O染色面积、密度较模型组减少,炎症气球样变较模型组减少,炎症因子的表达也减少。BBR干预组小鼠肝脏内NE活性,蛋白水平以及浓度均较模型组降低,kupffer活化程度也明显减轻。结论BBR有效将低NASH小鼠的体重、血糖、血脂以及肝功能,改善肝脏组织学炎症。降低肝脏内NE水平后减少kupffer细胞活化可能是其干预NASH的作用机制。
【关键词】：非酒精性脂肪性肝炎 库普弗细胞 中性粒细胞 中性粒细胞弹性蛋白酶 Toll样受体4 黄连素
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.1
【目录】：

• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-18
• 第一部分 NE在NASH kupffer细胞活化的作用和机制研究18-47
• 一、实验一 中性粒细胞介导NASH早期kupffer细胞活化的研究(动物实验）18-26
• (一) 实验材料与方法18-22
• 1. 实验动物18
• 2. 实验药物18-19
• 3. 实验议器19
• 4. 实验方法19-22
• (二) 实验结果22-23
• (三) 分析与讨论23-25
• (四) 小结25-26
• 二、实验二 NE在NASH发生发展中的作用（临床研究）26-37
• (一) 实验材料与方法26-27
• 1. 研究对象26
• 2. 研究方法26-27
• (二) 实验结果27-34
• (三) 分析与讨论34-36
• (四) 小结36-37
• 三、实验三 NE抑制剂Sivelestat防治NASH及抑制kupfeer细胞活化37-43
• (一) 实验材料与方法37-39
• 1. 实验动物37
• 2. 实验药物和试剂37
• 3. 实验议器37
• 4. 实验方法37-39
• (二) 实验结果39-40
• (三) 分析与讨论40-42
• (四) 小结42-43
• 四、实验四 rNE通过TLR4介导loipffer细胞活化的研究(体外研究，，此部分实验在香港大学医学院生物医药技术国家重点实验室完成)43-47
• (一) 实验材料与方法43-45
• 1. 实验动物43
• 2. 实验试剂及其配方43
• 3. 实验议器43-44
• 4. 实验方法44-45
• (二) 实验结果45-46
• (三) 分析与讨论46
• (四) 小结46-47
• 第二部分 BBR对非酒精性脂化性肝炎NE介导Kuffer活化的影响研究47-54
• (一) 实验材料与方法47-50
• 1. 实验动物47
• 2. 实验药物及试剂47
• 3. 实验议器47-48
• 4. 实验方法48-50
• (二) 实验结果50-52
• (三) 分析与讨论52-53
• (四) 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-60
• 附图60-76
• 致谢76-77
• 文献综述77-85
• 参考文献82-85

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