人工改造的EGS对乙型肝炎病毒基因表达及复制抑制效果的研究

发布时间：2017-08-21 20:39

  本文关键词：人工改造的EGS对乙型肝炎病毒基因表达及复制抑制效果的研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属嗜肝DNA病毒,它是目前肝脏疾病,如病毒性肝炎、肝硬化的主要原因。目前全球约有4亿人慢性感染乙型肝炎病毒。HBV能够在肝细胞中进行原发性感染和慢性感染,目前针对慢性乙肝肝炎的抗病毒治疗主要采用重组干扰素和以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物。但是迄今为止,由于治疗药物的副作用以及抗药毒株的产生,还没有药物能够根本性治疗HBV的慢性感染。因此,开发新型抗乙肝病毒慢性感染药物仍然是目前研究的重点和难点。核酶P是广泛存在于人体各种组织中的一种核酶,其主要功能是催化细胞内tRNA前体的成熟。EGS RNA可以与靶标mRNA部分互补配对形成类似tRNA前体的结构,并且能够招募细胞内的核酶P高效的降解靶标mRNA。在本研究中,通过DMS转化实验,在HBV的S mRNA, pre-S/L mRNA, pgRNA的重叠区域筛选出了可与EGS结合的靶位点,并根据此前的研究,设计出EGS突变体S-C386。本研究通过体外结合实验得到了EGS与靶标mRNA结合的最佳浓度,体外剪切实验表明,相较于根据天然ptRNA序列设计的EGS S-SER,改造后的EGS突变体S-C386招募核酶P分解靶标mRNA HepG2勺能力提升了50倍。减毒的沙门氏菌作为一种有效的口服基因药物载体,已经广泛应用于DNA疫苗和抗肿瘤药物的研发中。肝脏是沙门氏菌系统性感染后的主要聚集组织之一,并且沙门氏菌能够入侵并感染肝细胞。因此以减毒的沙门氏菌为载体,能够有效的帮助EGS在肝细胞中靶向性表达,提高EGS对HBV复制表达的抑制效率。通过细胞实验证明以沙门氏菌为载体的基因给药途径能够在HepG2细胞中高效表达各种EGS,并且没有明显的细胞毒性。以减毒沙门氏菌为载体在HepG2.215细胞中分别表达EGS S-C386与EGS S-SER,检测发现细胞中HBV RNA和蛋白的表达水平分别下降了97%和75%,带有HBV基因组DNA分别减少了6000倍和130倍。本研究表明,通过人工改造可以极大的提高EGS突变体抑制HBV基因表达和DNA复制的能力；此外也证明了通过沙门氏菌介导表达高效EGS突变体的基因疗法在抗HBV治疗方面具有很高的可行性。TP蛋白是HBV多聚酶的重要组成部分,能够行使引物的作用,启动病毒的逆转录过程。通过酵母双杂交系统,我们筛选出了14个与TP蛋白相互作用的宿主蛋白。通过研究TP蛋白与这些宿主蛋白的相互作用,有助于了解HBV基因组复制的机制,为抗HBV治疗提供新的方向。
【关键词】：乙型肝炎病毒 外部引导序列 核酶P 沙门氏菌
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 缩略词表13-14
• 第一章 引言14-30
• 1.1 乙型肝炎病毒概述14-21
• 1.1.1 乙型肝炎病毒简介14-17
• 1.1.2 乙型肝炎病毒的感染复制周期17-19
• 1.1.3 HBV相关的免疫应答19-20
• 1.1.4 HBV耐药性及停药反弹机制20
• 1.1.5 HBV治疗药物研究进展20-21
• 1.2 外部引导序列的概述21-24
• 1.2.1 核酶的简介21-22
• 1.2.2 影响核酶P催化的因素22-23
• 1.2.3 EGS的发现23
• 1.2.4 EGS在研究中的应用23-24
• 1.3 沙门氏菌概述24-30
• 1.3.1 沙门氏菌简介24
• 1.3.2 沙口氏菌的入侵机制24-25
• 1.3.3 减毒活疫苗载体研究进展25-26
• 1.3.4 沙门氏茵减毒株的构建26-27
• 1.3.5 减毒沙门氏菌载体的优点27-28
• 1.3.6 以减毒沙门氏茵为载体的活疫苗应用研究28-30
• 第二章 实验材料与方法30-56
• 2.1 实验仪器与设备30-31
• 2.2 基本实验材料与试剂31-32
• 2.3 常规分子克隆实验技术32-40
• 2.3.1 大肠杆菌DH5α化转感受态的制备32-33
• 2.3.2 大肠杆菌DH5α转化实验33-34
• 2.3.3 SDS碱裂解法粗提质粒34-35
• 2.3.5 Northern Blot实验35-40
• 2.4 酵母双杂交系列实验40-45
• 2.4.1 文库信息40
• 2.4.2 试剂与培养基准备40-42
• 2.4.3 文库滴定42
• 2.4.4 Bait菌株的构建42-43
• 2.4.5 酵母双杂交筛选文库43-44
• 2.4.6 X-gal显色实验44
• 2.4.7 酵母质粒提取44-45
• 2.5 细胞相关实验45-48
• 2.5.1 细胞的培养45-46
• 2.5.1.1 细胞培养基及试剂45
• 2.5.1.2 细胞复苏（以Hela细胞为例）45-46
• 2.5.1.3 细胞传代46
• 2.5.1.4 细胞冻存46
• 2.5.2 脂质体法转染细胞46-47
• 2.5.3 使用流式细胞仪对细胞进行检测和分选47-48
• 2.6 核酶P体外剪切HBV S RNA相关实验48-53
• 2.6.1 硫酸二甲酯转化实验48
• 2.6.2 核酶P的提取与鉴定48-50
• 2.6.3 基因的克隆与体外转录(以HBV S为例)50-52
• 2.6.4 EGS与RNA底物结合实验52
• 2.6.5 EGS介导核酶P剪切s38RNA的体外实验52-53
• 2.7 沙门氏菌侵染HepG2.215细胞的相关实验53-56
• 2.7.1 体外测定沙门氏菌的生长曲线53
• 2.7.2 以沙门氏菌为载体在人体细胞中表达EGS RNA53
• 2.7.3 沙门氏菌的入侵对细胞的毒性检测53-54
• 2.7.4 ELESA实验检测HBV E抗原、表面抗原浓度54
• 2.7.5 使用qPCR分析HBV capsid-associated DNA水平54-56
• 第三章 人工改造的EGS对HBV基因表达和复制抑制作用的研究56-76
• 3.1 研究背景56-57
• 3.2 实验结果57-69
• 3.2.1 分析S mRNA可被EGS结合的位点57-58
• 3.2.2 EGS介导核酶P对HBV的S RNA进行剪切的体外实验58-62
• 3.2.3 以沙门氏菌为载体在培养细胞中表达EGS62-65
• 3.2.4 以沙门氏菌为载体介导表达EGS,在细胞中抑制HBV的感染和复制65-69
• 3.3 讨论与小结69-71
• 3.4 研究展望——人工改造的EGS抗HBV的动物实验方案71-76
• 3.4.1 研究背景71-72
• 3.4.2 技术路线72-73
• 3.4.3 研究方案73-76
• 第四章 HBV TP蛋白与肝细胞表达蛋白相互作用的研究76-85
• 4.1 背景介绍76-78
• 4.1.1 TP蛋白的简介76-77
• 4.1.2 酵母双杂交原理77-78
• 4.2 实验结果78-83
• 4.2.1 文库滴度测定与转化率测定结果78-79
• 4.2.2 酵母质粒的提取与鉴定79-81
• 4.2.3 序列测定与分析81-83
• 4.3 分析与讨论83-85
• 参考文献85-102
• 攻读博士期间的学术成果102-104
• 致谢104

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本文编号：715004