MiR-148a经Hedgehog信号通路诱导肝星状细胞自噬与凋亡的研究

发布时间：2017-08-29 15:21

  本文关键词：MiR-148a经Hedgehog信号通路诱导肝星状细胞自噬与凋亡的研究

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【摘要】：第一章:肝星状细胞mi R-148a靶基因Gas1验证目的:证据显示Micro RNAs作为小短链非编码RNAs参与肝纤维化的发生及发展,本部分拟研究肝星状细胞(HSCs)在饥饿诱导状态下不同时点mi R-148a及Gas1(生长阻滞特异基因1)表达水平的差异并对mi R-148a预测的靶基因Gas1进行验证,以探讨HSCs在应激状态下mi R-148a生物学特性。方法:永生化HSCs系LX-2及T-6分别经EBSS培养不同时间点后以q RT-PCR检测mi R-148a及Gas1 m RNA表达水平差异;经生物信息学方法预测mi R-148a可能靶基因Gas1 m RNA,并以双荧光素酶试验系统进行验证;最后以mi R-148a模拟物及抑制剂通过脂质体2000转染LX-2及T-6后经Western blot和q RT-PCR法检测Gas1蛋白质及m RNA表达水平的变化,以明确mi R-148a对Gas1 m RNA的靶向调控作用。结果:Mi R-148a在HSCs系LX-2及T-6中表达水平随EBSS培养时间的延长逐步升高,在培养4 h达到高峰,且mi R-148a表达与Gas1水平呈负相关;生物信息学方法分析发现Gas1是mi R-148a靶基因之一,在转染克隆野生型Gas1 3'-UTRs质粒实验组中,经双荧光素酶试验系统检测表明mi R-148a可与Gas1 m RNA的3'-UTRs结合,从而抑制双荧光素酶活性;通过功能学研究显示mi R-148a模拟物及抑制剂转染后,与阴性对照相比,明显地抑制Gas1蛋白质及m RNA表达水平。结论:在饥饿诱导状态下,LX-2及T-6中mi R-148a水平呈现时间依赖性升高,并靶向抑制Gas1 m RN A表达,为进一步研究HSCs在自噬诱导状态下的生理特性提供新的思路,而mi R-148a可能成为肝纤维化治疗的新靶点。第二章:Gas1经Hedgehog信号通路抑制肝星状细胞自噬目的:生长阻滞特异基因1(Gas1)是Hedgehog信号通路上游激动因子,现已证实Hedgehog信号通路与细胞自噬活性关系密切。本部分拟探讨Gas1通过Hedgehog信号通路调节HSCs自噬活性及相应分子机制,为Gas1作为分子靶标干预肝纤维化提供新的思路。方法:分别以0、0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl Gas1处理LX-2及T-6细胞48 h后,通过Immunoblotting、荧光显微镜、透射电镜检测自噬相关蛋白、GFP-LC3分布及自噬小体形成;以Hedgehog信号通路特异性激动剂及抑制剂干预后检测Hedgehog通路中关键信号因子Patch1、Gli1及自噬标志蛋白(LC3-II、SQSTM1/p62)表达水平,以探讨Gas1调节LX-2及T-6细胞自噬活性及其可能机制。结果:与阴性对照组相比,Gas1抑制HSCs自噬相关蛋白的表达呈浓度依赖性,并可抑制自噬小体形成,其中以0.75μg/μl抑制作用最为显著;经Gas1 si RNA处理后Hedgehog通路关键组分被抑制,但LX-2及T-6细胞的自噬活性增强;分别以Hedgehog通路兴奋剂或抑制剂干预后,再以Gas1处理HSCs,LX-2及T-6细胞自噬活性明显减弱或增强。结论:1.Gas1抑制LX-2及T-6细胞的自噬活性。2.Gas1抑制HSCs自噬活性通过促进Hedgehog信号通路传导实现。第三章:Mi R-148a经Gas1诱导肝星状细胞自噬,抑制增殖、促进凋亡目的:Micro RNAs作为短链非编码RNAs参与到多种生物学过程,已有研究证实mi R-148a在肝纤维化组织及肝癌细胞中表达降低,但其对HSCs自噬活性及生物学特性的影响目前尚不明确,本部分拟探讨mi R-148a对HSCs自噬活性及增殖、凋亡的影响,以期为干预肝纤维化提供新的方向。方法:通过mi R-148a功能获得与功能丧失实验以Western blot、荧光显微镜、透射电镜以及自噬抑制剂Bafilomycin al预处理等实验方法检测HSCs自噬水平改变,以验证mi R-148a对HSCs自噬活性的调节作用;并通过MTS法、流式细胞术检测mi R-148a对HSCs增殖及凋亡影响。结果:Mi R-148a明显诱导饥饿诱导状态下HSCs的自噬活性,表现为促进LC3B转换及p62降解,荧光显微镜及透射电镜检测表现为免疫荧光蛋白聚集及促进自噬小体形成;抑制及过表达Gas1水平均可调节mi R-148a诱导的HSCs自噬活性;mi R-148a诱导饥饿状态下HSCs自噬是通过抑制Gas1表达发挥作用;经自噬抑制剂Bafilomycin al预处理后,mi R-148a显著提升HSCs自噬水平,并抑制HSCs增殖、促进凋亡。结论:Mi R-148a经Gas1可诱导肝星状细胞自噬活性,同时抑制HSCs增殖及促进凋亡,从而为逆转肝纤维化提供新思路。
【关键词】：肝星状细胞 mi R-148a 生长阻滞特异基因1 靶基因 生长阻滞特异基因1 自噬 Hedgehog通路 微小RNA-148a 生长阻滞特异基因1 自噬 肝星状细胞 凋亡
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-10
• 前言10-32
• 参考文献27-32
• 第一章 肝星状细胞mi R-148a靶基因Gas1验证32-62
• 引言32
• 1 实验材料32-40
• 2 实验方法40-48
• 3 结果48-55
• 4 讨论55-58
• 结论58-59
• 参考文献59-62
• 第二章 Gas1经Hedgehog信号通路抑制肝星状细胞自噬活性62-82
• 引言62-63
• 1 实验材料63-65
• 2 实验方法65-66
• 3 结果66-73
• 4 讨论73-78
• 结论78-79
• 参考文献79-82
• 第三章 Mi R-148a诱导肝星状细胞自噬，，抑制增殖及促进凋亡82-99
• 引言82
• 1 实验材料82-84
• 2 实验方法84-85
• 3 结果85-92
• 4 讨论92-95
• 结论95-96
• 参考文献96-99
• 全文总结与展望99-100
• 综述100-104
• 部分中英文缩略词表104-106
• 攻读博士期间科研成果106-107
• 致谢107

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本文编号：754026