人羊膜上皮细胞培养工艺及向肝样细胞分化的研究

发布时间：2017-09-03 03:33

  本文关键词：人羊膜上皮细胞培养工艺及向肝样细胞分化的研究

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【摘要】：目的 建立人羊膜上皮细胞分离、培养与冻存工艺,研究其基本的生物学特性,并进行人羊膜上皮细胞向肝样细胞分化的研究。方法无菌条件下收集剖宫产新生儿的羊膜,采用正交法对不同的分离、培养与冻存条件设计适宜的因素水平,采用与之相对应的正交表进行试验。以相同质量羊膜所得SSEA-4阳性细胞量为对照,研究胰酶浓度、消化时间与消化次数等影响因素对分离效果的影响；以SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量为对照,研究细胞接种密度、血清浓度与细胞生长因子EGF浓度等影响因素对培养效果的影响；以复苏细胞存活率为对照,研究细胞冻存密度、DMSO浓度与血清浓度等影响因素对冻存效果的影响。以此提出优化的人羊膜上皮细胞分离培养与冻存工艺。取原代、传代及冻存复苏细胞做形态学观察,绘制细胞生长曲线,对原代细胞作相关表面标志物的免疫荧光染色,并对原代及P4代细胞作免疫流式细胞检测。取P1代人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导分化,诱导组在5%FBS的DMEM/F12培养液中加入20ng/ml HGF、10ng/ml FGF4、10ng/mlIGF-1、500nM Dex诱导试剂组合,对照组只加入5%FBS的DMEM/F12培养液,诱导周期为三周。镜下对比诱导细胞与对照细胞形态的变化,诱导过程中细胞免疫荧光染色的变化,逆转录与荧光定量PCR检测诱导过程中肝细胞相关基因AFP、ALB、HNF4α与CYP1A2表达量的变化,并对诱导3周后hAECs细胞作糖原染色检测。结果经正交法数据分析得到,优化的胰酶消化羊膜上皮细胞的分离条件为：胰酶浓度0.25%,分4次消化,每次消化时间20min,分离因素影响大小依次为：消化次数消化时间胰酶浓度。优化的培养条件为：细胞接种密度为4x105/ml, EGF浓度为10ng/ml,血清浓度为5%,培养因素影响大小依次为：细胞接种密度血清浓度EGF浓度。优化的冻存条件为：细胞冻存密度为1×107/ml, DMSO浓度为10%,血清浓度为80%。冻存因素影响大小依次为：DMSO浓度细胞冻存密度血清浓度。原代接种细胞2-3d内下沉贴壁生长,贴壁后呈扁平不规则多角形,以铺路石样生长。传代后细胞贴壁与生长速度加快,冻存复苏的P2代细胞生长与扩增能力无明显下降。免疫荧光染色显示,原代细胞强表达CK19、SSEA-4,不表达Vimentin、CD45和HLA-DR。统计原代及P4代细胞流式检测数据,P4代细胞中SSEA-4与CK19免疫阳性细胞百分率较原代细胞有显著减少(P0.0001);而Vimentin和CD105较原代细胞有显著增加(P0.0001)；P4代与原代细胞的CD73免疫阳性细胞百分率均很高,且无显著性差异(P=0.1620.05)；HLA-DR在原代或P4代细胞中均不表达。人羊膜上皮细胞诱导2周后,细胞由椭圆形逐渐向多角扁平形状转变,细胞折光性增加。经免疫荧光染色显示,诱导1周后AFP表达量大,但3周后有明显下降；诱导3周的ALB和CK18的表达量均较1周的有明显增加；而SSEA-4的表达量逐渐减弱。荧光定量PCR采用2-Δ△ct法对各基因进行相对定量显示,诱导1周后人羊膜上皮细胞的AFP相对表达量显著大于诱导前(P0.05),诱导3周后,AFP相对表达量又显著降低(P0.05)；诱导3周后,ALB、HNF4α和CYP1A2三种基因的相对表达量均显著大于诱导前(P值均小于0.05)。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养与冻存的优化工艺。人羊膜上皮细胞易于获得且体外增殖能力强,表达胚胎干细胞保持未分化状态的表面标志物。体外可诱导向肝样细胞分化,表达肝细胞特异性基因,具备肝细胞特有功能特征,有望成为干细胞治疗终末期肝病良好的细胞来源。
【关键词】：人羊膜上皮细胞 培养 诱导分化 冻存 荧光定量PCR
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 专业名词中英文对照表12-13
• 1 绪论13-20
• 1.1 人羊膜上皮细胞与肝病13
• 1.2 国内外研究现状13-18
• 1.2.1 人羊膜上皮细胞的分离13-14
• 1.2.2 人羊膜上皮细胞的培养14-15
• 1.2.3 人羊膜上皮细胞的冻存15-16
• 1.2.4 人羊膜上皮细胞的表面标志物16-17
• 1.2.5 人羊膜上皮细胞向肝样细胞分化17-18
• 1.3 本研究的目的、内容与研究方法18-20
• 1.3.1 研究目的18
• 1.3.2 人羊膜上皮细胞分离培养及冻存工艺的优化18-19
• 1.3.3 人羊膜上皮细胞生物学特性的研究19
• 1.3.4 诱导人羊膜上皮细胞向肝样细胞分化19-20
• 2 人羊膜上皮细胞分离培养冻存工艺及其生物学特性的研究20-40
• 2.1 实验材料20
• 2.1.1 实验标本及其来源20
• 2.2 主要试剂与仪器设备20-23
• 2.2.1 实验试剂20-22
• 2.2.2 实验器械及仪器设备22
• 2.2.3 试剂配制22-23
• 2.3 实验方法23-27
• 2.3.1 实验标本采集23
• 2.3.2 羊膜上皮细胞分离23-24
• 2.3.3 羊膜上皮细胞培养24
• 2.3.4 羊膜上皮细胞传代24
• 2.3.5 羊膜上皮细胞冻存24-25
• 2.3.6 羊膜上皮细胞复苏25
• 2.3.7 活细胞计数25
• 2.3.8 羊膜上皮细胞生长曲线25-26
• 2.3.9 免疫荧光染色26
• 2.3.10 流式细胞仪检测免疫细胞阳性率26
• 2.3.11 苏木素-伊红染色26
• 2.3.12 统计学分析26-27
• 2.4 实验结果27-36
• 2.4.1 羊膜上皮细胞分离27-28
• 2.4.2 羊膜上皮细胞培养28-30
• 2.4.3 羊膜上皮细胞冻存30-32
• 2.4.4 培养细胞的形态学特征32-33
• 2.4.5 苏木素-伊红染色33
• 2.4.6 羊膜上皮细胞生长曲线33-34
• 2.4.7 免疫荧光染色检测结果34-35
• 2.4.8 免疫流式细胞检测结果35
• 2.4.9 流式检测条状统计图35-36
• 2.5 讨论36-38
• 2.6 结论38-40
• 3 人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导分化的研究40-54
• 3.1 主要试剂和仪器设备40-42
• 3.1.1 实验试剂40-41
• 3.1.2 实验仪器41-42
• 3.2 实验方法42-45
• 3.2.1 体外肝细胞样细胞诱导体系的建立42
• 3.2.2 免疫荧光染色42
• 3.2.3 糖原染色42
• 3.2.4 总RNA的抽提42-43
• 3.2.5 总RNA定量与电泳43
• 3.2.6 逆转录PCR合成cDNA43-44
• 3.2.7 肝细胞关键基因荧光定量PCR反应44-45
• 3.3 实验结果45-51
• 3.3.1 羊膜上皮细胞诱导组与对照组细胞形态学观察46
• 3.3.2 羊膜上皮细胞诱导后的免疫荧光染色46-48
• 3.3.3 荧光定量RCR检测诱导过程中羊膜上皮细胞的肝细胞特异性基因的表达48-51
• 3.3.4 羊膜上皮细胞诱导后的糖原染色51
• 3.4 讨论51-53
• 3.5 结论53-54
• 参考文献54-59
• 附录59-65
• 作者简介65

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本文编号：782639