肝再生增强因子对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用研究

发布时间：2017-09-05 05:25

  本文关键词：肝再生增强因子对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用研究

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【摘要】：肝脏是人体最大的消化器官。由于消化功能的需要,肝脏持续的接收来自胃肠道的血液,这些血液中含有大量的外来抗原。为了抵御外来抗原,肝脏内网状的肝血窦周围含有大量的免疫细胞,存在复杂的免疫反应。为了保护自身细胞不被过激的免疫反应所伤害,肝脏处于免疫排斥和免疫耐受的平衡状态。病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多种肝脏疾病的发生与发展均与肝脏免疫失衡有关。研究肝脏中的免疫调节物质对肝脏疾病的预防及治疗都具有非常重要的意义。肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一种具有热稳定性,无种属特异性的小分子蛋白。先前ALR的研究主要集中在促进肝细胞再生、抑制细胞凋亡和促进线粒体基因表达等方面。外源性给予重组ALR蛋白能够改善药物性肝损伤、肝硬化和实验性肝纤维化大鼠肝脏功能。在多种毒物诱导的肝损伤动物模型中,ALR可促进肝细胞再生,减轻急性肝损伤,改善肝功能,增加动物存活时间和提高动物存活率。近来,研究发现ALR能够抑制T细胞、NK细胞等多种免疫细胞的增殖和激活,具有免疫调节作用。由于重组ALR蛋白的稳定性差、生物利用度低等原因,体内研究较少,其发挥免疫调节的作用机制尚不明确。基因治疗的方法弥补了重组蛋白的不足。本文通过基因治疗的方法研究ALR对刀豆蛋白A (Concanavalin A, Con A)诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用,对ALR的免疫调节功能进行了研究。本实验室先前已经成功的构建hALR重组质粒与微环,并应用于肝纤维化治疗研究。本研究在此基础上,大量的制备了hALR的重组微环。ALR重组微环通过水动力转染,显著地提高小鼠肝脏内ALR的表达。在30 mg/kg Con A诱导的重度免疫性肝损伤动物模型中,经过ALR微环转染后小鼠的存活时间与存活率相比Con A造模组有显著增加。在15mg/kg Con A诱导的轻度免疫性肝损伤动物模型中,ALR组小鼠血清的谷丙转氨酶与谷草转氨酶相比Con A造模组有显著的降低。与Con A造模组相比,ALR组中血清的TNF-a和IL-6蛋白水平有显著的降低,但IFN-γ没有明显变化。上述实验结果表明ALR在肝脏中表达的增加可以减轻Con A诱发的免疫性肝损伤,对免疫性肝损伤的小鼠具有保护作用。因此,我们对ALR的免疫调节机制做进一步研究。通过荧光实时定量PCR检测,ALR组小鼠肝脏内的炎性因子TNF-a mRNA和IL-6 mRNA显著的低于ConA造模组,IFN-γ mRNA则没有显著差异。该结果与先前的血清蛋白检测结果一致,证实ALR在Con A诱导的肝炎中可以降低TNF-α和IL-6的表达,但不能抑制IFN-γ。随后又对肝脏中iNOS mRNA、趋化因子CXCL-10 mRNA和CCL-3 mRNA进行检查,相比Con A造模组,ALR能够降低iNOS、趋化因子CXCL-10和CCL-3的表达。流式细胞术检测结果显示ALR组小鼠肝脏内淋巴细胞的比例、CD4和CD8 T细胞的阳性率显著的低于Con A造模组。该结果说明ALR抑制了T淋巴细胞在肝组织中的浸润与激活。此外,Western免疫印迹结果显示,ALR组小鼠肝脏中NF-xB p65和 IxBa蛋白磷酸化的比例显著低于Con A造模组,说明ALR抑制了NF-xB信号通路活化。相比Con A造模组,ALR组小鼠肝脏中磷酸化的JNK和p38-MAPK也有显著的下调,说明ALR对JNK与MAPK信号通路也存在抑制作用。以上结果表明ALR通过抑制炎性细胞因子、趋化因子、T淋巴细胞和多条信号通路减轻了Con A诱导的免疫性肝损伤,证实ALR具有免疫调节作用。
【关键词】：肝再生增强因子 免疫调节 基因治疗 刀豆蛋白A
【学位授予单位】：沈阳药科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 缩略词表14-16
• 第一章 前言16-21
• 1.1 肝脏与免疫16-17
• 1.2 肝脏的免疫耐受17-18
• 1.3 ALR与免疫18-19
• 1.4 基因治疗19-20
• 1.5 研究的意义20-21
• 第二章 ALR微环载体的制备及表达21-34
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 工程菌与实验动物21
• 2.1.2 主要试剂21-22
• 2.1.3 试剂盒22
• 2.1.4 培养基及溶液22-23
• 2.1.5 主要仪器23
• 2.2 实验方法23-29
• 2.2.1 ALR微环真核表达载体的大量制备23-25
• 2.2.2 ALR微环真核表达载体的酶切鉴定25
• 2.2.3 水动力转染25
• 2.2.4 ALR表达的检测25-29
• 2.3 实验结果29-30
• 2.3.1 ALR微环真核表达载体的酶切鉴定结果29-30
• 2.3.2 ALR水动力转染的表达结果30
• 2.4 讨论30-34
• 第三章 免疫性肝损伤动物模型的建立34-40
• 3.1 实验材料34
• 3.1.1 实验动物34
• 3.1.2 试剂及试剂盒34
• 3.2 实验方法34-37
• 3.2.1 Con A诱导小鼠产生免疫性肝炎34-35
• 3.2.2 采集血液标本和动物观察35
• 3.2.3 测定血清转氨酶(ALT、AST)35
• 3.2.4 测定血清炎性因子(TNF-α,IL-6,IFN-γ)35-37
• 3.3 实验结果37-38
• 3.3.1 小鼠一般状态37
• 3.3.2 血清转氨酶的测定结果37-38
• 3.3.3 血清炎性因子的测定结果38
• 3.4 讨论38-40
• 第四章 ALR对免疫性肝损伤的保护作用40-59
• 4.1 实验材料40-42
• 4.1.1 实验动物与工程菌40
• 4.1.2 主要试剂与试剂盒40-41
• 4.1.3 引物41-42
• 4.1.4 主要仪器42
• 4.2 实验方法42-47
• 4.2.1 微环DNA大量提取42
• 4.2.2 实验动物ALR转染和Con A诱导造模42-43
• 4.2.3 血清转氨酶(ALT、AST)含量测定43
• 4.2.4 血清促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)含量测定43
• 4.2.5 肝脏RNA分析43-45
• 4.2.6 肝脏蛋白Western blot分析45
• 4.2.7 肝脏淋巴细胞的分离45-46
• 4.2.8 流式细胞分析46-47
• 4.2.9 统计学方法47
• 4.3 实验结果47-55
• 4.3.1 转染过程中动物的一般状态47
• 4.3.2 高剂量Con A存活实验结果47-48
• 4.3.3 肝脏中ALR的测定结果48
• 4.3.4 血清转氨酶的测定结果48-49
• 4.3.5 血清中促炎性细胞因子的测定结果49-50
• 4.3.6 肝脏中促炎性细胞因子mRNA的测定结果50
• 4.3.7 ALR对肝脏趋化因子的影响50-51
• 4.3.8 ALR对肝脏淋巴细胞分型的影响51-53
• 4.3.9 ALR对肝脏中NF-κB信号通路的影响53
• 4.3.10 ALR对肝脏中JNK和MAPK信号通路的影响53-54
• 4.3.11 肝脏中iNOS的变化54-55
• 4.4 讨论55-59
• 4.4.1 ALR对炎性细胞因子和iNOS的影响55-56
• 4.4.2 ALR对T淋巴细胞分型的影响56
• 4.4.3 ALR对趋化因子的影响56-57
• 4.4.4 ALR对NF-κB信号通路的影响57
• 4.4.5 ALR对JNK和p38 MAPK的影响57-59
• 参考文献59-66
• 全文总结66-67
• 论文发表情况67-68
• 致谢68-69
• 附件69-76
• 学位论文自愿预先检测申请表76

【参考文献】

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本文编号：796091